精准设计疫苗

马玺，汤可骏，杜雨棽2,，孙仁2,

1. 浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科，杭州 310003； 2. 美国加利福尼亚大学洛杉矶分校分子与医学药理学系，洛杉矶 90095； 3. 浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所，杭州 310009

疫苗被认为是20世纪最重要的公共卫生成果之一，机体通过接种传染性病原体或其免疫原性组分而获得阻止外来病原体复制和建立感染的免疫力，从而达到预防传染病的目的，极大降低了感染性疾病的发病率和死亡率，显著保障了全球公共健康[1-3]。仅以结核为例，至2015年，结核全球死亡率较2000年降低22%[4]。但当前全球传染病如流行性感冒(简称流感)、艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)、肝炎、肺结核、血吸虫病等的防治形势依然严峻，肿瘤、自身免疫性疾病、代谢病等也日益危害人类健康，因此研发有效且安全的预防性和治疗性疫苗遏制这些疾病，对保障人民健康、经济发展、社会稳定具有重要意义。近年来，随着免疫学、微生物学、病毒学领域基础研究的不断深入，以及分子生物学技术的不断进步，疫苗研发得到了飞速发展。现代疫苗的主要原理是通过表达特异性抗原激活机体适应性免疫产生免疫记忆，通常只能抵抗具有该特异性抗原的病原体；或利用减毒病原体刺激机体免疫，但往往弱化了免疫原性而导致预防效力不足。在面对流感等具有高抗原变异率的疾病时，能有效抵抗不同亚型流感病毒的通用型疫苗则更为经济、高效。基于此，本实验室构建了一类新型候选疫苗——精准设计疫苗，为下一代疫苗的研发提供了新思路。本文在此对疫苗的发展史和精准设计疫苗的研究作一综述。

1 传统疫苗

早在11世纪，我国就有了接种天花患者脓液来预防天花的案例。18世纪英国医生爱德华·琴纳发明了接种牛痘预防天花的方法，并称此技术为疫苗接种(vaccination)，自此疫苗学诞生。19世纪末开始，得益于路易斯·巴斯德等的卓越研究，炭疽、霍乱、结核、白喉、伤寒、鼠疫等30多种传染病疫苗问世。这类传统疫苗主要分为灭活疫苗和减毒活疫苗。

1.1 灭活疫苗

灭活疫苗是选用免疫原性强的病原体进行培养，用物理或化学方法将具有感染性的完整的病原体杀死，再经纯化制成。虽然灭活疫苗已失去对机体的感染力，但其仍保持免疫原性，可刺激机体产生相应的免疫力，抵抗野生毒株的感染。我国使用的灭活疫苗有流感疫苗、狂犬病疫苗和甲型肝炎灭活疫苗等。其易于保存，可制成多联苗或多价苗，同时由于灭活疫苗无法在体内复制，不会返祖成致病力强的病毒，保证了疫苗的安全性并适用于免疫缺陷者[5]。但正是由于其无法复制，对人体刺激时间短，一般需多次大剂量注射，并加入佐剂增强免疫应答以获得强而持久的免疫力，且缺乏自然感染产生的局部黏膜反应。

1.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是病原体经各种物理、化学、生物方法处理后，其毒性亚单位结构改变，毒性减弱，而结合亚单位活性保持不变，保留了免疫原性的一类疫苗，如麻腮风(麻疹-流行性腮腺炎-风疹)联合减毒活疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗等。与灭活疫苗相比，在不诱发临床症状的前提下，减毒活疫苗可刺激机体产生类似自然感染的隐性感染，引发局部黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫，免疫力强且持久，一般小剂量接种一次即可获得长期甚至终生保护的作用[5]。减毒活疫苗的劣势在于其存在毒力返祖的风险，可能产生疫苗衍生病毒，不适用于免疫力低弱和缺陷人群，且须在低温条件下保存及运输，有效期相对较短。

2 现代疫苗

随着分子生物学理论和技术水平不断完善和提高，亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、重组活载体疫苗等现代疫苗相继问世。同时，随着免疫学研究的深入，疫苗的功能不断拓展，人们通过疫苗诱导体内特异性免疫应答，以限制或根除某种业已出现并确立的病原体或疾病如肿瘤、免疫缺陷病、代谢病、超敏反应等，这类疫苗被称为治疗性疫苗。这些疫苗通过在体内表达病原体或异常细胞特异性抗原，激活机体适应性免疫，攻击病原体或异常细胞，从而达到预防和治疗的效果。

2.1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是筛选、提取并纯化细菌和病毒具有免疫原性的特殊抗原成分如类毒素、亚细胞结构、膜表面成分等，与载体结合后制成的疫苗，如流感病毒裂解型亚单位疫苗、乙型肝炎亚单位疫苗、伤寒Vi多糖疫苗等。亚单位疫苗避免了无关抗原的抗体产生，从而减少了疫苗的不良反应和疫苗相关疾病，且不具有复制能力，适用于免疫力低弱和缺陷人群[2]。亚单位疫苗引发的免疫类型与其成分有关。通常，蛋白类抗原刺激产生T细胞依赖性免疫反应，多糖类抗原引发T细胞非依赖性免疫应答。多糖类抗原的免疫原性一般较弱，可通过与蛋白结合强化免疫应答[2]。结合疫苗是一类将细菌多糖共价结合在蛋白载体上制备成的多糖-蛋白结合疫苗，如B型流感嗜血杆菌疫苗，可视为亚单位疫苗的一种。更常见的增强免疫强度的方式是添加佐剂。以Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)配体为例，TLR信号转导可加速抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)对抗原的摄取和加工，并促进树突细胞成熟，被越来越多应用于疫苗的设计和制备[6]。

除抗原和佐剂外，疫苗递送载体的选择也会显著影响其免疫效果。脂质体是由双层脂膜构成的密闭的向心性囊泡，结构延展性好，生物相容性高，抗原装载能力强，不仅可促进树突细胞活化成熟，还可加快胞内运输和抗原呈递[2]。近年来研究发现，DOTAP、SPC、DDA、DOPC等脂质体可分别作为肺炎型鼠疫[7]、乙型肝炎[8]、肺结核[9]、AIDS[10]等感染性疾病疫苗的载体，效果显著。此外，经过修饰改良后的不同大小、形态、材质、密度、表面电荷的无机纳米粒子(如AuNP)或有机纳米粒子(如PLGA)等候选载体，可能应用于流感、AIDS、疟疾、口蹄疫、黑素瘤等多种疾病的亚单位疫苗[2]。

2.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗是根据有效免疫原的氨基酸序列设计合成的多肽疫苗。相较于蛋白，多肽更易合成，且在体内可被APC更高效地摄取、处理和呈递。但这些小分子多肽可与大量非专职性APC上的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子直接结合，难以诱发强有效的免疫应答，其需交联模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)相关配体等佐剂增强效力[11]。黑素瘤、卵巢癌、胶质母细胞瘤等的合成肽疫苗正处于临床试验阶段[12]。

2.3 病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)疫苗

VLP疫苗是由一种或多种病毒蛋白组成的空壳结构，不包含病毒核酸，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似。目的病毒结构蛋白可通过基因工程技术在细菌、真菌、哺乳动物、植物细胞中获得表达，并在体内(真核细胞)或体外(原核细胞)组装成VLP。许多病毒结构蛋白具有自动组装成VLP的能力，具备很强的生物活性和免疫原性，且不具有感染性，生产时间短，有些已成功应用于临床，如人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)疫苗(Gardasil、Cervarix)、乙型肝炎疫苗(Recombivax HB、Engerix-B)。VLP还可作为疫苗载体，运载具有免疫原性的蛋白或多肽靶向诱导树突细胞成熟，进而刺激免疫应答发生。阿尔兹海默症[13]、糖尿病[14]、肿瘤[15-16]等多种疾病的治疗性VLP疫苗正处于临床试验阶段。

高危型HPV感染人体后可整合进入人体细胞基因组，是宫颈癌、阴道癌、外阴癌、咽喉癌等的重要致病因素[17]。积极防治HPV感染可有效降低上述癌症的发生率。研究发现，HPV衣壳蛋白L1表达后可自行组装成VLP，刺激机体产生强且持久的中和性抗体，将不同血清型的L1蛋白组合后即可达到交叉免疫保护的目的[18-19]。目前，市场上常用的二价、四价、九价HPV疫苗就是以L1蛋白为主体的VLP疫苗。

流感病毒表面糖蛋白HA和NA是引发抗体免疫应答的主体。针对HA的抗体能阻断病毒结合至细胞表面受体，从而防止病毒进入和感染。然而，抗原漂移(突变累积)和抗原转变(基因重排导致的片段交换)导致原有的保护性抗体失效，引发季节性大流行。流感VLP疫苗主要由杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统表达并折叠组装，可表达多种HA、NA、M1蛋白，以及高度保守的M2e、核蛋白、HA茎杆区，通过相互之间或与外源性蛋白组合，不仅能诱导出足够的抗体，还可增强T细胞应答，产生交叉性保护效应，从而在一定程度上实现广谱免疫预防作用。但当两种流感病毒抗原差异较大，则无法起到保护作用[20]。

2.4 DNA疫苗

DNA疫苗可以是裸DNA疫苗，也可以包含佐剂和载体。将编码某种蛋白抗原的DNA直接注射到动物体内，使外源基因在宿主细胞内得到表达，再呈递给免疫系统，从而诱导特异性体液免疫和细胞免疫，尤其是细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的杀伤作用。其免疫刺激的结构基础是非甲基化的CpG基序，又称为免疫刺激序列(immune stimulatory sequence，ISS)。DNA疫苗的优势在于表达产物以天然抗原的形式呈递给免疫系统，无逆转风险，生产周期短，技术简便且稳定性高[21]。DNA疫苗的有效性在动物模型中被证实，兽用DNA疫苗已上市，但其在人体试验中仍显示较弱的免疫原性，无法诱导出有效的免疫应答。原因可能是DNA被宿主细胞降解或转染效率低下，导致抗原表达水平受限[22]，因而目前尚无人用DNA疫苗上市。现多采用基因枪、电穿孔转染等方法提高转染效率，相关的流感H5 DNA疫苗[23]、寨卡GLS-5700疫苗[24]等正处于临床试验阶段。

2.5 RNA疫苗

RNA疫苗类似于DNA疫苗，只是外源编码序列为mRNA。1990年，Wolff等发现给小鼠肌内注射外源性mRNA后，小鼠体内表达其所编码蛋白，这为mRNA疫苗研发提供了依据。mRNA疫苗较DNA疫苗更具优势。首先，DNA疫苗可能整合到免疫宿主的基因组中，导致原癌基因活化或抑癌基因失活，有致癌的风险；其次，DNA疫苗必须穿过质膜和核膜两个屏障，进入细胞核内转录进而表达蛋白才能发挥效用，显著限制了DNA疫苗的转染效率，而mRNA疫苗可在胞质中直接翻译，无需转运至细胞核内[25]；最后，DNA疫苗可能诱发抗双链DNA的自身免疫反应，引起自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)[26-27]。目前，mRNA疫苗主要分为传统的非扩增型mRNA疫苗和自我扩增型mRNA(self-amplifying mRNA，SAM)疫苗，常用的递送方式为直接递送和载体递送(树突细胞、脂质纳米粒等)。

传统的非扩增型mRNA疫苗长度为2～3 kb，包括m7Gp3N帽、5’UTR、编码抗原的开放阅读框、3’UTR 和多聚A尾，结构较为简单。其缺陷在于半衰期短、结构不稳定、表达量低，需进一步修饰、优化，如在 5’UTR 和 3’UTR 区增加调控序列、修饰多聚A尾等[28]。研究发现，编码HA蛋白的抗流感mRNA疫苗可保护新生及老年(18个月)BALB/c小鼠，显著降低幼年和老年小鼠的流感疾病负担[29]。编码H10N8或H7N9的HA蛋白的mRNA疫苗可在小鼠、白鼬、灵长类动物中建立快速、坚固的免疫应答，且编码H10N8的HA蛋白的mRNA疫苗Ⅰ期临床试验已证实其对人体有效[25]。针对黑素瘤[30]、肾细胞癌[31]、前列腺癌[32]、非小细胞肺癌[25]等肿瘤的mRNA疫苗正处于临床试验阶段，且获得了部分积极成果。

SAM疫苗结构较为复杂，大小为9～10 kb。以甲病毒源性SAM疫苗为例，除包含非扩增型的结构外，还包含非结构蛋白基因序列和次基因组启动子[28]。其不仅能编码抗原，还含有病毒复制所需序列，具有复制能力，从而大幅提高蛋白表达量，且表达可持续2个月之久[25]。但由于RNA聚合酶的特异性，SAM疫苗可耐受的结构修饰和基因表达调控相当受限。抗流感的M1-NP SAM疫苗[33]、抗巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)的gH/gL 糖蛋白复合体SAM疫苗[34]在动物实验中证明有效，但尚无相关临床证据。

尽管目前mRNA的递送效率和疫苗的稳定性仍制约其发展，但其在肿瘤治疗、广谱抗流感防治及快速应对新型病原体流行等领域中的潜在优势不容小觑。

2.6 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗是利用基因工程技术将病毒、细菌或寄生虫弱毒株构建成载体(载体本身不致病)，将编码特异性抗原的外源基因插入其中并获得表达的重组疫苗。此类疫苗可诱导产生类似自然感染的强且持久的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫[35-36]，理论上具备免疫效应优、成本低、安全性高等优点，还可同时插入多个外源基因，是当前疫苗研发的主要方向之一。常用的细菌载体有卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)、乳酸杆菌、大肠埃希菌等，主要的病毒活载体有痘病毒、腺病毒等。现已有10余种兽用病毒、细菌活载体疫苗上市，如新城疫疫苗、狂犬病疫苗等[37]。

重组活载体疫苗仍有一定的限制因素。首先，载体种类的选择和基因组的插入位点显著影响源基因的表达，有待病毒和细菌基因组结构的进一步阐明和优化。有研究发现，不同载体引发的免疫反应有所差别。改良型痘苗病毒安卡拉株(modified vaccinia virus Ankara，MVA)和痘苗病毒纽约株(New York vaccinia virus，NYVAC)同属于痘病毒，但MVA主要刺激产生CD8+T细胞，而NYVAC则更多刺激特异性CD4+T细胞[38]。其次，载体基因在体内的表达产物可能影响目的抗原的免疫原性，或存在免疫竞争，且疫苗效力在既往感染过载体的宿主中明显削弱[39-40]。人用活载体疫苗如抗人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)的gp140-腺病毒26型载体疫苗[41]、抗埃博拉的糖蛋白-水疱性口炎病毒疫苗[42]、抗前列腺癌的PSA-牛痘/鸡痘病毒疫苗[43]等正处临床前或临床试验阶段。

3 下一代疫苗——精准设计疫苗

在面对流感等具有高抗原变异率的疾病时，目前主要在每年流感季节到来之前预测可能的流行株制备疫苗，故疫苗需每年更新，高危人群需每年接种，而预测失准则可能无法有效抵抗当季流感流行。因此，研发可有效抵抗不同亚型流感病毒的通用型疫苗更为经济、有效。此外，病原体逐渐发展出的免疫逃避机制也是限制现有疫苗保护效力的主要原因之一。基于此，本实验室构建了一类新型候选疫苗——精准设计疫苗，为下一代疫苗的研发提供了新思路。

本实验室建立了一种全新且能可靠鉴定全基因组核苷酸位点、区域功能的系统生物学方法，可用于筛选具有特定功能或特性的基因位点。这种应用高通量技术和反向遗传学技术，高通量、大规模地定向筛选全基因组内特异位点、区域，进而精准设计的重组疫苗被命名为精准设计疫苗。利用该方法，本实验室通过筛选干扰素(interferon，IFN)高敏感性突变，成功构建了“超干扰素敏感”(hyper-interferon-sensitive，HIS)疫苗。该候选流感疫苗本质是一种减毒活疫苗，对IFN高度敏感，在机体内可诱导局灶性、一过性的大量IFN生成，并激发强烈的适应性免疫应答，具有广谱跨亚型抗病毒能力，兼具有效性和安全性[44]。

能应对各亚型流感病毒的通用流感疫苗的研发意义重大。在机体抗病毒免疫中，IFN不仅是天然免疫的重要成分，同时调节适应性免疫，刺激树突细胞成熟，参与T细胞发育激活并促进抗体生成。在宿主和病毒的长期共同进化过程中，流感病毒发展出多种抗IFN免疫逃避机制。针对这一免疫逃避机制，本实验室首先构建了几乎包含流感病毒A/WSN/33全基因组(>95%)的点突变文库，然后利用基因组高通量测序系统筛选IFN高敏感性突变位点，最后将其中8个高敏感性突变位点(3个位于PB1，3个位于M1，2个位于NS1)重组入同一个流感病毒构建出HIS病毒。该重组病毒在IFN缺陷的宿主中大量复制，但由于失去了抗IFN功能，其在IFN正常的宿主中可被有效抑制。HIS病毒可激发局灶性、一过性的大量IFN产生，并表现出极强的免疫原性，可诱导强烈的适应性免疫应答，产生中和抗体。尤为重要的是，HIS病毒感染的小鼠TCR Vβ谱型、NP抗原特异性CD8+T细胞数量和增殖能力均与野生型病毒相似，证明了HIS病毒诱导的T细胞免疫应答的强度和广度。同时，在HIS病毒预感染的小鼠和白鼬中，同源和异源流感病毒感染后迅速激发机体强烈的二次免疫应答，证明了HIS病毒的广谱保护效应[44]。

综上所述，HIS病毒具有如下优势：全基因组分析筛选使病毒改造和疫苗设计更为精准、高效；只引发局灶性的、一过性的IFN反应，避免了全身炎症反应的发生[44-45]；激发的流感病毒保守结构特异性T细胞使其具有广谱保护效力[46]；多片段多位点重组降低了病毒返祖的风险；其在IFN系统缺陷细胞如Vero细胞中可大量复制，保证疫苗的快速大量制备；经口鼻接种可引发自然感染途径下的机体免疫反应；可快速制备，因而对储存、运输要求不高。

这种反向免疫学方法可广泛应用于制备抗原高变异性，或具有免疫逃逸能力难以激活强烈免疫反应，或灭活疫苗预防效果不佳的病原体的减毒活疫苗。通过全基因组研究，在体内或体外设定各类细胞因子、树突细胞、自然杀伤细胞、T细胞等筛选条件，检测突变病毒适应性的变化，不仅可检测出正性突变，还可发现对免疫环境敏感的负性突变，实现病原体特性蛋白或位点的筛选，进而研发安全有效的传染病减毒活疫苗。不同于传统疫苗和现代疫苗的抗原特异性免疫应答和免疫记忆，精准设计疫苗可靶向作用于天然免疫和(或)适应性免疫的特定组分，诱导交叉免疫反应，激发具有广谱保护效应的免疫应答。

同时，该新型疫苗研究平台可用于肿瘤疫苗的研发。一方面，利用该方法筛选具有特殊复制适应性的病毒突变位点，进而改造病毒以增强其肿瘤细胞靶向性和免疫原性，使其无法在正常细胞中复制，但可在肿瘤细胞中复制，通过直接裂解细胞释放子代病毒而清除肿瘤，或通过表达抗原诱导树突细胞以抗原呈递的方式促进免疫系统靶向杀伤肿瘤细胞。另一方面，利用二代测序技术和构建算法模型，发现甚至预测新抗原(neoantigen)或肿瘤特异性抗原[47-48]，进而利用该新型疫苗研发平台构建既表达新抗原又可激活强烈免疫反应的肿瘤疫苗回输至体内或病变组织，诱导机体靶向杀伤带有上述抗原的肿瘤细胞。同理，其在代谢性疾病、自身免疫性疾病、移植等领域均具有广阔的应用前景。

4 结语

人体免疫系统是抵御病原体侵犯的最重要防线，但在长期共进化过程中，病原体逐渐具备了多种逃避宿主免疫系统监测和杀伤的手段，对人类健康产生重大威胁。尽管近年来疫苗学获得了飞速发展，但仍面临着诸多挑战：病原体免疫原的特性和致病机制；影响疾病易感性和免疫强度的宿主因素及其机制；如何改进疫苗组分和性质(全病原体/免疫原、佐剂、载体、递送方式、剂型等)以提高疫苗的有效性和安全性。在治疗性疫苗方面，如何激活自身免疫系统靶向杀伤异常细胞是研究的关键。本实验室搭建的高通量全基因组精准筛选平台不仅为基因组各位点功能和致病机制的深入研究提供了技术支持，还为下一代疫苗的广泛应用奠定了基础。

精准医疗是基于个体基因、环境、生活方式等特征进行个性化治疗，促使复杂的遗传生物信息向临床诊治转化，引发了医疗健康领域的新一轮变革[49-50]。同样基于病原体或异常细胞的基因组学、转录组学和蛋白质组学信息的精准设计疫苗，则通过发现与机体免疫息息相关的重要靶基因、蛋白、通路，靶向设计出更为安全有效的预防性和治疗性疫苗，在个体层面将使得疾病预防和治疗更为精准、有效、安全，在宏观层面则将对公共健康领域产生重大影响，可显著节约成本，改善人类健康，降低疾病负担。这种全新的疫苗研发方法将推动疫苗学进入新的发展阶段。

值得关注的是，随着分子生物学研究的不断深入和细化，鉴于生物体结构、功能的复杂性，进行传统生物学研究可能进展有限，而在生物学研究中积极融合计算机、化学、物理等学科的理论和技术，将为疫苗学和生命科学的发展开辟新天地。