新型基质对生物膜微生物数量和酶活性的影响

马恒轶，葛利云，吴灵萍，邓欢欢

(温州医科大学 公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035)

随着城市的发展，城区河流护堤岸坡因水土保持等功能需求普遍采用硬质化护砌，切断了水体与陆地间的物质、能量及信息交流，绿色植物和微生物失去了生存空间，造成生物多样性降低、生态系统瓦解破碎[1]。由于城市河道独特的历史形成原因和现状，对于城市河流的修复，若完全重建代价太大，而如果进行合理的改造，城市河道也能够提供适当的生物栖息地，可行的办法之一是在保留原有水工结构基础上增加一些人工措施来调整栖息地，如美国应用较多的抛石及碎石护岸、日本的石笼和鱼巢砖，以及欧洲开发的生态浮床[2]。本研究引入一种新型人工基质，系聚氯乙烯或聚丙烯经乱丝热熔相互搭接，再经模具挤压成型的三维网状材料，以温州医科大学环校河为研究对象，通过测定、比较新型人工基质和石岸基质夏(6月)、秋(9月)、冬(12月)3季生物膜上的磷酸酶、脲酶、脱氢酶活性和微生物总数量，来验证新型人工基质的效用。现将试验结果总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 处理设计

设定3个试验点：分别使用种植植物的新型人工基质(A)、新型人工基质(B)、石头基质(C)。其中，在A、B两点上分别悬挂一定数量提前切好的小块方形基质，C点悬挂若干量的鹅卵石。

1.2 样品采集

分别在A、B、C点捞取布设的基质块和石块，用蒸馏水洗去表面附着的非生物杂质，放入烧杯中，加入约400 mL蒸馏水，采用物理法使表面生物膜剥落。超声处理15 min(超声频率50 Hz)，将溶液转移到1 000 mL锥形瓶中，加入适量微型玻璃珠，充分振荡15 min，得到均匀的生物膜混合液，以此作为生物膜样品进行测定[3]，每个样点做3个平行。

1.3 指标测定

1.3.1 微生物总数

取生物膜混合液样品1 mL，经100倍梯度稀释，然后用无颗粒甲醛进行固定(终浓度2%)，固定后的样品用无菌超纯水进行5～10倍(视不同样品而定)稀释。取10 mL稀释液超声波振荡10 min，加入100 μL浓度为100 μg·mL-1的DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，Sigma，USA)静置染色10 min，然后用手持式手动泵(MityVac，USA)以<1.33 kPa的真空压将染色后的样品过滤至黑背景聚碳酸滤膜(孔径0.22 μm，直径25 mm，PoretiesTM，USA)上，滴1滴无荧光镜油，至荧光显微镜下观察计数。每个样品观察20个视野[4]，计数公式如下：

式中，n表示微生物丰富度(个·mL-1)，N表示样品稀释倍数，A表示所有视野中细菌的平均数(个)，S1表示滤膜的有效过滤面积(μm2)，S2表示视野面积(μm2)，V表示过滤水样体积(mL)。将得到的微生物丰富度(n)乘以400，再除以基质或者石块的总表面积，得到单位面积基质或者石块的微生物个数。

1.3.2 磷酸酶活性

基质磷酸酶活性的测定采用磷酸苯二钠法[5]：取10 mL生物膜悬液离心后弃去上清液，用1 mL蒸馏水悬浮于150 mL锥形瓶中。加入2.5 mL甲苯，振荡15 min后，加入20 mL 0.5%的磷酸苯二钠(pH值7.0)溶液，37 ℃水浴培养24 h。培养结束后，加入100 mL 0.3%铝钾矾溶液，过滤。取5 mL滤液，加入5 mL硼酸缓冲液和4滴氯代溴苯醌亚胺试剂，摇匀显色。静置30 min后，于波长660 nm处比色测定，换算出酚量。以1 g生物膜每24 h释放出酚的量表示酶活性。

1.3.3 脲酶活性

基质脲酶活性的测定采用奈氏比色法[5]：取10 mL生物膜溶液离心之后弃去上清液，用1 mL蒸馏水浓缩，置于50 mL离心管中。加入10 mL pH 值6.7磷酸缓冲液及0.5 mL甲苯，混合处理15 min后，加入10 mL 10%尿素溶液，37 ℃水浴培养48 h。培养结束后，取出加入20 mL 1 mol·L-1KCl溶液，充分摇匀10 min。将悬液用致密滤纸过滤，吸取经过稀释的滤液1 mL，加入1 mL 25%酒石酸钾钠、0.8 mL纳氏试剂进行显色。静置10 min后，以空白为对照，在波长460 nm处比色测定。以1 g生物膜每48 h释放出氨的量表示酶活性。

1.3.4 脱氢酶活性

基质脱氢酶活性测定采用TTC-脱氢酶测定法[6]：取10 mL生物膜悬液，4 000 r·min-1离心5 min，浓缩成2 mL制备液，弃去上清液，用1 mL蒸馏水浓缩于15 mL离心管中，依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1 mol·L-1葡萄糖溶液、0.5%TTC各2 mL，37 ℃恒温水浴培养6 h。取出，加2滴浓硫酸终止反应，准确加入5 mL甲苯，振荡摇匀，4 000 r·min-1离心5 min，取有机溶剂层比色。在上述条件下，以l h产生1 μg三苯基甲臜(TF)的量作为1个酶活力单位。

1.4 数据分析

在Excel 2007上整理数据，利用SPSS 22.0进行双因素方差分析，利用Graphpad Prism 5.0绘图。

2 结果与分析

2.1 微生物数量

在淡水生态系统中，浮游细菌的丰富度、生物量及浮游细菌种群的基因多样性均表现出随时间变化的特征[7-8]。在对瑞士和法国境内的3个高山湖泊细菌丰度的研究中发现，异养细菌爆发期均出现在秋季[9]。本试验结果同样显示，各试验点的微生物数量均以秋季最高(表1)。双因素方差分析结果显示，不同基质及不同季节对试验结果有极显著(P<0.01)影响。不分季节，各试验点的微生物数量均表现为种植植物的新型人工基质(A)>新型人工基质(B)>石头基质(C)。说明新型人工基质相较石头基质可以更有效地富集水体中的微生物，为微生物提供更加适合的生存环境。陈永华等[10]证明，植物根系生长环境越好, 根系附近微生物的生存环境也越适宜, 微生物的数量越多。这与本试验中种植植物的新型人工基质的微生物数量最多的结果一致。

表1 各试验点不同季节的微生物数量 107 cm-2

2.2 基质酶活

2.2.1 磷酸酶活性

磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由羟基，是一种普遍存在于多种生物体中的酶[11]。双因素方差分析结果显示，不同基质及不同季节对生物膜磷酸酶活性分别有显著(P<0.05)与极显著(P<0.01)影响。整体来看(表2)，磷酸酶活性以秋季最高，冬季最低。在同一季节，不同试验点生物膜上的磷酸酶活性均表现为种植植物的新型人工基质(A)>新型人工基质(B)>石头基质(C)，与微生物数量的变化规律一致。

表2 各试验点不同季节的磷酸酶活性 mg·g-1·d-1

2.2.2 脲酶活性

脲酶是一种酰胺酶，以尿素为底物，酶促水解有机物分子中的肽键，使之转化为NH3、CO2和H2O，广泛分布于细菌、真菌和高等植物中[12]，其活性与基质中的微生物量、有机质含量、氮含量呈正相关[1]。双因素方差分析结果显示，不同基质及不同季节对生物膜磷酸酶活性有显著(P<0.05)影响。与不同试验点不同季节磷酸酶的活性变化相似，脲酶活性同样以秋季最高(表3)，在同一季节，不同试验点生物膜上的脲酶活性均表现为种植植物的新型人工基质(A)>新型人工基质(B)>石头基质(C)，与微生物数量的变化规律一致。但与磷酸酶不同的是，冬季脲酶活性要高于夏季。这主要与脲酶的反应方式有关：冬季植物茎叶部分枯萎，进入微生物系统，为系统增加了尿素来源，从而导致相关微生物大量繁殖，脲酶活性因而增加[11]。

表3 各试验点不同季节的脲酶活性 mg·g-1·d-1

2.2.3 脱氢酶活性

脱氢酶是氧化过程中作用在代谢物上的第一个酶，其活性在很大程度上反映了活性微生物的数量以及生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质的降解能力[13]。双因素方差分析结果显示，不同基质及不同季节对生物膜脱氢酶活性分别有显著(P<0.05)与极显著(P<0.01)影响。整体来看(表4)，不同试验点生物膜上的脱氢酶活性均表现为种植植物的新型人工基质(A)>新型人工基质(B)>石头基质(C)，与微生物数量的变化规律一致。但与磷酸酶和脲酶不同的是，脱氢酶活性在夏季最高、秋季最低。这是因为：在6月，生命活动相对旺盛，脱氢酶需要大量地转化有机质为系统提供生命元素；在12月，由于系统中植物枯落，腐殖质大量增加，脱氢酶需提高活性以加快转化有机质。这与周巧红等[14]的研究结果一致。

表4 各试验点不同季节的脱氢酶活性 μg·g-1·h-1

3 小结

本研究对同一河段中种植植物的新型人工基质、新型人工基质和石头基质上生物膜磷酸酶、脲酶和脱氢酶活性及微生物总数进行测定。结果表明，微生物数量在秋季最高，磷酸酶和脲酶活性在秋季最高，而脱氢酶活性在夏季最高、秋季最低。在同一季节，3种酶活性都表现出种植植物的新型人工基质>新型人工基质>石头基质的趋势，微生物数量的变化趋势也与此一致。说明新型人工基质可以为微生物提供更多的生存场所和更好的生存环境。在新型人工基质上种植植物后，植物根系的生长可为微生物生存提供营养，进一步提高微生物数量。受此影响，酶活性也相应增强，从而更好地起到净化水质的作用。

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