ClC-3氯通道过表达对小鼠甲状腺结构及功能的影响*

谭秋婵， 陈湛如， 俞美声 ， 梁协稠， 赵 婵 ， 高 宏， 郑衍芳， 伍嘉宝， 朱林燕， 王立伟△， 陈丽新△

(暨南大学基础医学院 1生理学系， 2药理学系， 广东 广州 510632； 3广东省计划生育科学技术研究所， 广东 广州 510600)

甲状腺激素对人体发育以及代谢起着重要的调控作用。碘(I)是甲状腺激素合成不可缺少的原材料，甲状腺含碘量占全身总碘量的90%。碘以碘离子(I-)的形式存在于血液中，I-从血液进入甲状腺合成甲状腺激素经历了一系列转运过程。现已被公认，甲状腺细胞基底膜的碘离子摄取是由钠碘同向转运体(sodium iodide symporter，NIS)特异性介导的[1]。甲状腺激素合成的一个重要环节是I-从甲状腺滤泡上皮细胞流入滤泡腔中参与甲状腺球蛋白碘化，有研究指出，该过程是多种转运体和阴离子通道等共同作用的结果，氯通道也可能参与I-排出的过程[2-3]。

电压门控氯离子通道(voltage-gated chloride channel，ClC) 由CLCN基因编码，ClC-3是ClC家族中的一员，广泛分布于脑、肾、心脏、骨骼肌和腺体组织，在质膜、细胞核和细胞器上都有表达。我们前期对ClC-3氯通道做了一系列研究, 证明该通道受多种因素调控，参与了细胞的容积调节、 周期调节和凋亡等多种生理活动[4-6]。我们在对ClC-3氯通道的研究过程中发现其对阴离子选择性并不高，阴离子通透性大小表现为I->Br->Cl-> 葡萄糖酸根[7-8]，提示ClC-3很有可能参与了甲状腺I-的跨膜转运进而影响甲状腺激素的合成与分泌， 但是ClC-3对甲状腺的影响目前还未见报道。 本研究拟构建ClC-3转基因小鼠，探讨ClC-3的表达与甲状腺结构与功能的关系。

材 料 和 方 法

1动物

ClC-3转基因小鼠委托Cyagen Biosciences构建，动物合格编号为TGS120401AH01，小鼠品系为FVB，FVB野生型(wild type，WT)小鼠为本实验对照组小鼠。实验小鼠在SPF级环境中分笼饲养，室温为(22±2)℃，湿度为60%～80%，12 h昼夜交替照明，隔日更换垫料，自由摄食摄水。

2主要试剂

引物由生工生物工程有限公司合成，见表1；Prime ScriptTMRT Reagent Kit购自TaKaRa；2×Tap PCR Master Mix试剂盒购自天根生化科技有限公司；兔抗小鼠ClC-3多克隆抗体购自Abcam；小鼠总三碘甲状腺原氨酸(total triiodothyronine，TT3)、小鼠总甲状腺素(total thyroxine，TT4)和小鼠促甲状腺素(thyrotropin，TSH) ELISA试剂盒均购自Bio-Swamp。

3主要方法

3.1ClC-3转基因小鼠鉴定 剪取3周龄转基因小鼠尾尖0.4 cm～0.6 cm，采用苯酚抽提法提取基因组DNA，行PCR反应扩增ClC-3基因。引物序列见表1。取10 μL PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采集结果。在440 bp出现阳性条带的小鼠分组到ClC-3高表达组中，出现阴性条带的小鼠则舍弃。

3.2标本的采集 对3月龄的WT小鼠和经鉴定为ClC-3高表达的小鼠进行行为学监测，称重后测量肛温，摘取眼球采血后处死。取出甲状腺组织后称重并常规行HE染色观察其结构的变化。

表1 引物序列

3.3qPCR检测甲状腺ClC-3 mRNA的表达 苯酚法提取甲状腺组织总RNA，于微量紫外分光光度计测定RNA的A260/A280，其值在1.9～2.1表明纯度较好。 参照PrimeScriptTMRT reagent Kit说明进行逆转录，参照北京天根公司2×Tap PCR Master Mix试剂盒说明进行qPCR检测。引物序物见表1。

3.4Western blot检测小鼠甲状腺ClC-3蛋白的表达 收集甲状腺组织，按50 g/L 加入RIPA裂解液，冰上匀浆30 min，4℃、 12 000×g离心10 min,取上清，BCA 法进行蛋白定量。制备7% SDS-PAG，电泳分离蛋白，电转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，兔抗小鼠ClC-3Ⅰ抗(1∶800) 4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG( 1∶5 000) 37℃孵育1 h，洗涤后于凝胶成像系统采集数据。

3.5免疫荧光技术检测小鼠甲状腺ClC-3的表达和分布 甲状腺组织经多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋后切片。石蜡切片经60 ℃烘片24 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水；0.1 mol/L、pH 6.0的枸橼酸液修复， 0.3 % Triton X-100透膜，10 %绵羊血清封闭；ClC-3Ⅰ抗(1∶50)4℃孵育过夜；Cy3标记的Ⅱ抗(1∶100)室温避光孵育1 h；5 mg/L的DAPI室温下染色5 min；激光共聚焦显微镜下观察。

3.6ELISA法测小鼠TT3、TT4和TSH 摘取小鼠眼球收集血液，室温自然凝固30 min，1 000 ×g离心15 min，收集上清。按Bio-Swamp ELISA试剂盒说明操作，450 nm 波长处依序测量各孔的A值。以标准品的浓度为横坐标，A值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品的A值由标准曲线计算出样品浓度。

4统计学处理

用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异采用t检验方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1ClC-3转基因小鼠的鉴定

本研究中构建ClC-3转基因小鼠转入质粒为pLV.EX3d.P/neo-EF1A>CLCN3> IRES/eGFP。采用PCR检测鼠尾组织并鉴定。在琼脂糖凝胶上，转基因小鼠会出现440 bp的条带，野生型小鼠则在此不会出现条带，200 bp处显示内参照条带，见图1。

2ClC-3转基因和WT小鼠甲状腺ClC-3的表达差异

通过qPCR和Western blot检测2组小鼠甲状腺中ClC-3的表达情况，发现无论是在mRNA水平还是蛋白水平，ClC-3转基因小鼠ClC-3的表达量都高于野生型小鼠(P<0.05)。通过免疫荧光观察2组小鼠甲状腺ClC-3的表达与分布，结果发现，2组小鼠中均观察到被红色荧光标记的ClC-3，主要分布在甲状腺滤泡上皮细胞的胞膜上，ClC-3转基因鼠表达量明显较高，见图2。

Figure 1. PCR was performed with DNA extracted from the tail of 3-weeks-old FVB mice.

图1PCR鉴定ClC-3高表达小鼠

Figure 2. ClC-3 expression and distribution in the thyroid gland from wild type andClC-3 transgene mice. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsWT group.

图2野生型和ClC-3转基因小鼠甲状腺ClC-3的表达与分布

3ClC-3转基因小鼠甲状腺形态及结构的改变

大体形态上，ClC-3转基因小鼠甲状腺相比野生型小鼠的更大，组织明显充血，见图3A；称量结果显示，ClC-3转基因小鼠甲状腺重量普遍增加(P<0.05)，见图3B。HE染色结果显示， 野生型小鼠甲状腺滤泡上皮细胞多为单层立方或扁平状，甲状腺滤泡腔多为中等大小，滤泡腔内充满红染胶质；而ClC-3转基因小鼠滤泡上皮细胞明显肿大，增生变化明显，细胞呈高柱状改变，甲状腺滤泡腔大小差异较大，部分甲状腺滤泡腔增大，胶质增多，见图3C。统计结果显示，与野生型小鼠甲状腺滤泡腔面积相比，高表达组滤泡腔平均面积明显较大 (P<0.05)，见图3D。

Figure 3. Transgene mice have morphologic and histologic changes in the thyroid gland. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsWT group.

图3转基因小鼠甲状腺形态结构的改变

4ClC-3转基因小鼠体重、肛温及行为表现的改变

与野生型小鼠相比，ClC-3转基因小鼠体型略小,体重偏低(P<0.05)；肛温较高，但无统计学差异； 摄食量也明显增大(P<0.05)，饮水量未见明显差异，见表2。行为学观察发现，大部分ClC-3转基因小鼠活动较频繁、易激怒、好斗、毛须竖起，甚至脱落。总体表现与甲亢高代谢症候群相似。

表2野生型小鼠和ClC-3转基因小鼠体重、肛温、饮水量以及摄食量的测量

Table 2. Detection of weight, anal temperature, water intake and food consumption of WT andClC-3 transgene mice(Mean±SD.n=20)

GroupWeight(g)Analtemperature(℃)Waterintake(mL)Foodconsumption(g)WT28．16±0．6536．35±0．124．37±0．234．59±0．32ClC⁃3transgene25．32±1．03∗36．72±0．214．23±0．316．38±0．58∗

*P<0.05vsWT group.

5ClC-3转基因小鼠血清中的TT3、TT4和TSH的改变

ClC-3转基因小鼠血清中TT3和TT4平均浓度均明显高于野生型小鼠(P<0.05)；虽然ClC-3转基因小鼠TSH浓度与野生型小鼠的浓度不具有统计学差异，但ClC-3转基因小鼠TSH浓度有降低的趋势，见图4。

Figure 4. Detection of serum TT4, TT3 and TSH concentrations inClC-3 transgene mice and WT mice. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsWT group.

图4野生型和ClC-3转基因小鼠血清中的TT4、TT3和TSH的表达

讨 论

氯通道是体内最主要的阴离子通道，氯通道有多种不同类型，包括钙激活氯通道、囊性纤维化跨膜转运调节因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator， CFTR)氯通道、电压依赖性氯通道和容积敏感氯通道等，它介导体内最多的阴离子-Cl-顺电-化学梯度被动扩散。氯通道在甲状腺中的作用近来受到重视。CFTR在甲状腺上有表达，并且可能与滤泡增生相关[9]，囊性纤维化病人(CFTR基因缺陷)存在亚临床甲状腺功能减退[10]。钙激活性氯通道ANO1主要分布在甲状腺滤泡上皮细胞的顶膜上，可能介导顶膜的I-流出[11]。ClC-5是ClC氯通道家族中的一个亚型，其缺失可导致I-外流延迟，并且可导致TSH和T4正常的甲状腺肿[12]。我们的前期实验发现，人甲状腺细胞表达ClC氯通道家族ClC-1～ClC-7的mRNA中 ClC-3表达最高，是ClC-5的10多倍，那ClC-3是否影响着甲状腺的结构和功能呢？

本课题组在对ClC-3氯通道的研究中发现，当ClC-3通道开放时，产生一个有较明显外向整流、无时间依赖性和电压依赖性失活、对容积改变敏感的氯电流，该通道对I-的通透性大于Cl-， 提示ClC-3很有可能参与了甲状腺I-转运进而影响甲状腺激素合成与分泌。

与WT组小鼠相比，ClC-3转基因组小鼠甲状腺ClC-3表达明显增多,且主要分布在细胞膜上。ClC-3氯通道主要介导阴离子顺着浓度梯度的跨膜转运，尤其是对I-的通透性最为明显，因而我们推测ClC-3很可能参与了细胞内高碘的甲状腺细胞的碘外排。

形态学研究发现，ClC-3转基因小鼠倾向于发生甲状腺增生肥大，滤泡上皮细胞增生肥大，呈高柱状改变，滤泡腔明显增大。这可能是由于ClC-3高表达后，促进了碘的外排，更多的碘离子外排到滤泡腔内，甲状腺球蛋白碘化增多，一方面导致甲状腺细胞中甲状腺球蛋白合成增多，细胞体积增大；另一方面导致大量的碘化甲状腺球蛋白堆积在滤泡腔内，滤泡腔增大，最终导致小鼠甲状腺组织增生肥大。

日常行为表现和体征研究发现，ClC-3转基因小鼠行为表现与甲亢的的高代谢症候群相似。血清总甲状腺素TT3和TT4是判定甲状腺功能最基本的指标。采血测甲状腺激素水平则发现ClC-3过表达组小鼠TT4明显增高，TT3也有增高的趋势，甲状腺分泌功能明显增强。这很可能是因为ClC-3表达增多后，促进碘离子外排到滤泡腔内，促进了甲状腺球蛋白的碘化过程，从而促进了甲状腺激素的合成；研究还发现转基因组小鼠TSH有下降的趋势但并不具有统计学差异。TSH是腺垂体分泌的促进甲状腺生长和机能的激素，一方面受到T3和T4反馈性抑制[13]，另一方面受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素的促进，二者互相拮抗，它们组成下丘脑-腺垂体-甲状腺轴。因此，本研究中TSH的变化不明显，很可能与下丘脑和垂体的功能相关。

综上所述，本研究发现ClC-3过表达可引起小鼠甲状腺组织增生，T3和T4分泌增多；ClC-3过表达小鼠表现类似甲状腺功能亢进的高代谢症状。

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