HPLC法测定橙子中L-抗坏血酸含量的研究

张晓燕，张立秋，曲平，史晓丽，刘欢，*（.通化师范学院，吉林通化3400；.通化出入境检验检疫局技术中心，吉林通化3400）

橙子，又名“黄果”，为芸香科植物香橙的果实，含有丰富的维生素C（Vitamin C，VC）[1]。维生素 C 又称抗坏血酸（Ascorbic Acid），是一种水溶性维生素，对人体有较高的营养价值，是人体所必需的营养素[2]。经医学研究发现，它可以提高免疫力，保护牙齿、牙龈，减少皮肤中的黑色素沉着，促进伤口愈合，预防癌症、心脏病、肝硬化、中风等疾病的效果[3]。缺乏时可引起造血机制障碍、贫血、微血管壁通透性增加，脆性增加，容易出血等坏血病症状，故其对人体健康有着重要的意义[4]。在人体内，维生素C是一种高效的抗氧化剂，能用来减轻抗坏血酸过氧化物酶基底的氧化能力[3]，而且维生素C在食品工业上常被用作酸味剂、抗氧化剂及强化剂。维生素C在人体内不能合成，主要是从膳食中获取，蔬菜和水果是维生素C的重要来源。而橙子含有丰富的维生素C。因此，测定橙子中的维生素C的含量具有重要的意义。

维生素C有4种异构体，即L-抗坏血酸，D-抗坏血酸，L-异抗坏血酸，D-异抗坏血酸[5]。其中以L-抗坏血酸的含量及检测方法居多，薛刚等[6]用2，4-二硝基苯肼比色法测定婴儿配方奶粉中L-抗坏血酸的含量；张捷莉等[7]用紫外分光光度法测定维多康中L-抗坏血酸的含量；另外还有使用碘量法[8-9]、荧光法[10-11]等方法进行的检测。但由于L-抗坏血酸具有较强的还原性，遇热见光都容易分解，在中性和碱性条件下不稳定。这些方法的选择性较差，检测方法操作步骤复杂，试剂和试样溶液不稳定、灵敏度偏低、费时等缺点，尤其是颜色深的试样，其溶液颜色背景干扰大[12]。本研究采用高效液相色谱法测定橙子中L-抗坏血酸的含量，该方法具有快速、高效、灵敏度高等特点。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 材料和试剂

橙子：欣明达超市；偏磷酸、磷酸三钠、草酸、磷酸（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；L-半胱氨酸（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；甲醇（色谱纯）：Thermo Fisher Scientific；L-抗坏血酸标准品（纯度99.9%以上）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.2 仪器

高效液相色谱仪（LC-20AT型）：日本岛津有限公司；电子天平（YP1002）：上海衡际科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（T6新世纪型）：北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平（AL104型）：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；超声波清洗器（KQ-100E型）：昆山市超声仪器有限公司；pH计（PHS-3C型）：上海仪电科学仪器股份有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9101-3S型）：上海三发科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品溶液的制备

1.2.1.1 L-抗坏血酸提取剂的选择

L-抗坏血酸具有较强的还原性，易受热、光、空气等因素影响，但在酸性溶液中却很稳定[13-14]。为防止标准品及样品中的L-抗坏血酸被氧化分解，本试验选用草酸溶液、偏磷酸溶液作为提取剂，来提取标准品及样品中的L-抗坏血酸。使用紫外可见分光光度计分别测定用偏磷酸溶液和草酸溶液做提取剂的样品的吸光度，由于使用偏磷酸溶液做提取剂样品的吸光度大于使用草酸溶液做提取剂样品的吸光度，所以本试验选择使用偏磷酸溶液做提取剂。

1.2.1.2 样品处理

将去除皮的橙子精确称取20 g加入等质量的20 g/L的偏磷酸溶液，在避光的条件下，放入研钵中进行捣碎研磨，研磨充分之后精密称取均匀样液6.8 g于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L的偏磷酸溶液震荡溶解并定容，用滤纸进行过滤，超声5 min并标记此样品为样品1。在样品1中准确量取20 mL的样液加入10 mL 10 g/L的L-半胱氨酸溶液，用100 g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.0，超声10 min，再用85%磷酸调节pH至2.6。用水将溶液全部转移到50 mL棕色容量瓶中，定容至刻度并标记为样品1-1。从样品1中准确量取20 mL的样液用水将样液全部转移到50 mL棕色容量瓶中，定容至刻度并标记为样品1-2。在分析前使用0.45 μm滤膜过滤。

1.2.1.3 样品溶液的选择

分别精密吸取样品1-1溶液与样品1-2溶液10 μL注入高效液相色谱仪进行检测，观察样品溶液的色谱峰面积。结果表明，调pH样液的色谱峰面积大于未调pH样液的色谱峰面积。所以本试验选择样品1-1作为样品溶液。

1.2.2 标准品溶液的制备

精确称取L-抗坏血酸标准品25 mg放入25 mL的棕色容量瓶中，用20 g/L的偏磷酸溶液震荡溶解并定容至刻度，配成1 mg/mL的L-抗坏血酸标准品溶液，作为储备液。依次精密吸取储备液10、50、100、200、500 μL于10 mL容量瓶中，用20 g/L的偏磷酸溶液稀释并定容至刻度，配成浓度分别为1、5、10、20、50 μg/mL的L-抗坏血酸标准品溶液。

1.3 色谱条件的选择

检测波长的选择：将配好的L-抗坏血酸标准品溶液用SPD-20A紫外可见检测器在210 nm～310 nm范围内进行扫描检测。

流动相比例的选择：选择0.05 mol/L磷酸溶液-甲醇为 85∶15、87 ∶13、90∶10、95∶5这 4种配比作为流动相比例，进样检测。

柱温的选择：分别在20、25、30℃温度下进行检测。

流速的选择：分别以 0.800、1.000、1.200 mL/min的流速进样检测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

经过对色谱条件的比较分析得到结果，检测波长在245 nm处有最大吸收波长且杂峰干扰较少，基线相对稳定。流动相以0.05 mol/L磷酸溶液-甲醇（90∶10）的配比时出峰时间较短，出峰型较好。柱温的改变对于色谱峰的出峰时间和峰型没有明显变化，但实验室的室温接近25℃。流速过快出峰的时间较早，与溶剂峰比较接近，故选0.800 mL/min。确定本试验的色谱条件为检测波长：245 nm；流动相比例：0.05 mol/L磷酸溶液-甲醇（90 ∶10）；柱温：25℃；流速：0.800 mL/min。

2.2 定性分析

分别精密吸取溶剂、L-抗坏血酸标准品溶液、样品溶液各10 μL注入液相色谱仪，进行检测，根据出峰时间进行定性分析，结果如图1。

图1 溶剂、标准品及样品色谱图Fig.1 The chromatograms of solvent，standard substance and sample

由图1可知，L-抗坏血酸标准品溶液色谱峰出峰在4.835 min，样品溶液色谱峰出峰在4.829 min，溶剂在该时间段没有色谱峰，可以确定样品溶液中含有L-抗坏血酸。

2.3 标准曲线的绘制

L-抗坏血酸标准品溶液用0.45 μm滤膜过滤后，分别取不同浓度的L-抗坏血酸标准品溶液10 μL，将标准品溶液逐次进样分析，测定不同浓度的L-抗坏血酸标准品溶液浓度所对应的峰面积。以L-抗坏血酸标准品溶液浓度（μg/mL）为横坐标x，相对应的峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。得线性回归方程：Y=60 408.6x+38 583.7，相关系数：R2=0.999 6（n=5）。结果表明 L（+）-抗坏血酸浓度在 1μg/mL～50μg/mL 范围内具有良好的线性关系。以2倍基线噪声所对应的浓度计算本方法的检出限，L（+）-抗坏血酸的检出限为0.5 μg/mL。标准曲线如图2所示。

图2 标准曲线图Fig.2 Figure of standard curve

2.4 精密度试验

精密吸取L-抗坏血酸标准品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6次进行检测，得到的色谱峰面积分别为 6 125 033、6 162 932、6 181 420、6 192 873、6 201 210、6 250 472。如表1所示。

表1 精密度测定结果Table 1 Determined results of precision

根据表1得出峰面积的相对标准偏差RSD＝0.67%，试验结果表明该方法测定结果的精密度良好。

2.5 样品含量测定

精密吸取样品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，测得色谱峰面积为1 170 272，根据标准曲线进行定量分析，L-抗坏血酸的浓度为18.734 μg/mL，以外标法计算含量，结果得样品溶液中L-抗坏血酸的含量为68.88 mg/100 g。

2.6 重现性试验

将同一样品进行3次平行试验，按1.2.1.2处理后按照上述所设定的色谱检测条件进行检测，3次检测的峰面积分别为120 823、121 701、124 915，计算得到样品中含有L-抗坏血酸的浓度分别为1.36、1.38、1.43 μg/mL，通过计算相对标准偏差RSD=1.76%，结果说明本试验所采用的方法准确度较高。

2.7 稳定性试验

将样品溶液分别于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h精密吸取10 μL注入液相色谱仪进行测定。结果表明，L-抗坏血酸的色谱峰在8 h内比较稳定，9 h之后L-抗坏血酸标准品溶液的色谱峰峰型发生改变，说明L-抗坏血酸在8 h之内比较稳定。

3 结论

本试验采用高效液相色谱法测定橙子中L-抗坏血酸的含量。根据定性分析试验可以确定4.829 min处出现的色谱峰为L-抗坏血酸的特征色谱峰。以不同浓度L-抗坏血酸标准品获得标准曲线Y=60 408.6x+38 583.7，线性相关系数 R2=0.999 6（n=5），在 1 μg/mL～50 μg/mL范围内L-抗坏血酸具有良好的线性关系。检出限为0.5 μg/mL，试验方法较为灵敏。连续6次进样测得精密度的相对标准偏差RSD=0.67%，试验色谱条件精密度良好。3次平行试验获得的相对标准偏差RSD=1.76%，重现性良好，采用的试验方法准确度较高。稳定性试验表明L-抗坏血酸在8 h内比较稳定。测得样品溶液中L-抗坏血酸的含量为68.88 mg/100 g。从样品的色谱图可知，该方法分析L-抗坏血酸的含量大约需要5 min，具有快速的特点，且本试验方法无需特殊试剂、操作简便，可减少L-抗坏血酸的损失。本试验方法也可以为其它蔬菜和水果中L-抗坏血酸含量的检测提供参考。

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