RF-LAMP技术检测鸡肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌

张蕴哲，杨倩，马晓燕，杨澜，张伟，，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；2.河北农业大学理工学院，河北沧州061100）

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica，Y.enterocolitica）作为一种食源性的病原菌，是革兰氏阴性菌，不产芽孢，菌体外无荚膜，菌体周围有周鞭毛生长[1]。该菌广泛存在于各种动物的体内，动物可长期携带该菌并通过粪便排出，进而引起食品的污染[2]。Y.enterocolitica是一种嗜冷菌，在0℃也可存活并缓慢生长。在冷藏过程中可能被Y.enterocolitica污染的肉制品，会增加家中儿童与该菌直接接触的概率[2-3]。由肉制品感染给儿童的过程是亚洲人群感染耶氏菌的主要途径[4]。因此，建立一种高效、快速的检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，对于保障人类健康和食品安全显得尤为迫切。

目前国内检测Y.enterocolitica的方法以传统生化培养方法为主，该种方法操作复杂、耗时长，不能满足快速检测的需求[5]。快速检测Y.enterocolitica的方法有免疫学检测方法和分子生物学检测方法等。其中，分子生物学检测方法包括聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）[6]、实时荧光 PCR[7-8]、环介导等温扩增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）[5]、滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）[9]等方法。PCR方法快速、灵敏，但结果的判定需要进行繁琐的电泳，不利于在基层检测机构普及。

LAMP反应在具有链置换活性的DNA聚合酶催化下[10]，于恒温条件中短时间即可完成靶基因的高效扩增，在微生物检测领域有广泛的应用。本研究在LAMP技术的基础上，将荧光染料SYBR GreenⅠ加入反应体系。通过实时荧光监测仪对荧光信号强度的搜集，实现实时定性检测，建立实时荧光环介导等温扩增技术（Real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification，RF-LAMP）检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本试验所用菌株见表1。

表1 试验用菌种Table 1 Bacterial strains used in this study

1.1.2 样品

鸡肉：保定市某超市。

1.1.3 主要培养基和试剂

营养肉汤、营养琼脂、LB液体培养基和LB固体培养基：北京陆桥技术股份有限公司。Bst DNA聚合酶、限制性内切酶TaqⅠ、MgCl2和dNTPs：大连宝生物工程有限公司；甜菜碱和荧光试剂：Sigma公司；实时荧光LAMP内、外引物合成于大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA大量提取试剂盒：北京华大基因科技股份有限公司。

1.1.4 主要仪器

数显超级恒温水浴锅:金坛市杰瑞尔电器有限公司；DH6000AB型电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；实时荧光监测仪：德国ESE Gmbh公司；DYY-10C型电泳仪：北京市六一仪器厂；UVI pro凝胶成像系统：英国UVITEC公司；QYC-200全温摇床：上海新苗医疗器械制造有限公司；TGL-16G离心机：上海安亭科学仪器厂；Whatman T Gradient PCR扩增仪：德国Biometra公司。

1.2 方法

1.2.1 纯菌的培养

取保藏的 Y.enterocolitica（CMCC 52302）接种于灭菌的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。

1.2.2 DNA模板的制备

采用热裂解法进行DNA模板的提取。

1）取过夜培养的菌悬液1.5 mL于灭菌离心管中，11 000 r/m离心1 min，将上清液弃去。

2）用100 μL灭菌水将菌体沉淀洗涤2次，然后再加入灭菌水100 μL，振荡使菌体充分悬浮。

3）在沸水浴中将菌悬液煮沸10 min，取出离心，11 000 r/min离心1 min，将上清液转移至另一新的灭菌离心管中，保存在-20℃，备用。

1.2.3 引物设计

引物设计的好坏直接影响反应的特异性和扩增效率[11]。对Genebank中已经公布的小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因的序列进行同源性对比分析（基因号为AY004311.1）。针对Y.enterocolitica的保守序列利用在线设计软件（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计引物，最终确定的引物包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），引物信息如表2所示。

1.2.4 实时荧光LAMP反应体系

外引物F3和B3为0.5 μmol/L、内引物FIP和BIP为 3 μmol/L、dNTPs添加量为 2.5 μL、甜菜碱 1 mmol/L、MgSO4为 0.5 mmol/L、Bst DNA 聚合酶添加量为 1 μL、10×Bst DNA聚合酶缓冲液添加量为2.0 μL、模板DNA 1 μL、荧光染料 0.5 μL，无菌双蒸水补足体积至 25 μL。扩增反应条件：62℃、60 min。

表2 实时荧光LAMP所用引物Table 2 Primers used in RF-LAMP

1.2.5 酶切分析实时荧光LAMP反应产物

对实时荧光LAMP产物进行酶切分析，用于验证其产物的特异性[12]。具体反应体系如下：LAMP扩增产物为5 μL，Taq I buffer（10×）为2 μL，Taq I限制性内切酶为2 μL，无菌双蒸水补足体积至20 μL，轻轻混匀然后离心，37℃下保存1 h～16 h。酶切产物进行3.0%琼脂糖凝胶电泳，观察并分析结果。

1.2.6 实时荧光LAMP的特异性

对表1所列特异性试验菌株采用热裂解法进行基因组DNA的提取，阴性对照以无菌双蒸水作为模板。按照前述建立的实时荧光LAMP反应体系及程序进行反应，扩增后取5 μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，以验证实时荧光LAMP引物的特异性。

1.2.7 实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度

用灭菌的生理盐水对过夜培养的Y.enterocolitica菌液进行10倍系列梯度稀释。将稀释的菌液涂板计数，以确定其纯培养物的活菌数。此外，每个稀释度的菌液分别吸取1 mL，12 000 r/min离心1 min，弃去上清液，用1 mL生理盐水将菌体沉淀悬浮，采用热裂解法提取基因组DNA，进行实时荧光LAMP反应，以确定实时荧光LAMP反应的灵敏度。

1.2.8 实时荧光LAMP检测人工污染鸡肉的检出限

在对鸡肉进行Y.enterocolitica的人工污染前，按照国标法GB/T 4789.8-2016《食品微生物学检验——小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》对鸡肉进行检测，确定鸡肉中是没有Y.enterocolitica存在的。取25 g均质的鸡肉，加入225 mL灭菌生理盐水，制成鸡肉匀浆液。用灭菌的生理盐水对匀浆液进行10倍系列梯度稀释，采用热裂解法对每个稀释度进行Y.enterocolitica基因组DNA的提取，用于实时荧光LAMP检出限的测定。

2 结果与分析

2.1 酶切分析实时荧光LAMP反应产物

实时荧光LAMP反应产物是按照一定的方式生成的，通过酶切反应将反应产物的大小单一化，进而可以确定扩增是否准确[13]。本研究利用TaqⅠ限制性内切酶，主要产生143 bp和197 bp的DNA片段。酶切结果如图1所示，片段大小与理论值相符。

图1 实时荧光LAMP扩增产物酶切分析Fig.1 Restriction analysis of the RF-LAMP products

2.2 实时荧光LAMP的特异性

实时荧光LAMP的特异性试验见图2。

图2 实时荧光LAMP的特异性试验Fig.2 The specificity test of RF-LAMP

从图2中可以看出，用于实时荧光LAMP特异性试验的13株试验菌株中，1株Y.enterocolitica有明显的扩增峰出现，仪器自动判定为阳性；其他12株非Y.enterocolitica菌检测均未出现扩增峰，判定为阴性。表明本研究建立的方法特异性强。

2.3 实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度

实时荧光LAMP反应的灵敏度试验见图3。

图3 实时荧光LAMP反应的灵敏度试验Fig.3 Sensitivity test using RF-LAMP

如图3所示，当Y.enterocolitica纯培养物浓度为6.1×105CFU/mL~6.1×101CFU/mL 时，荧光曲线出现明显的扩增峰，仪器自动判定为阳性；当浓度为6.1×100CFU/mL时，荧光曲线平缓，未出现扩增峰，判定为阴性。因此，本研究所建立实时荧光LAMP检测Y.enterocolitica的灵敏度为61 CFU/mL。

2.4 实时荧光LAMP检测人工污染鸡肉的检出限

由平板菌落计数可知人为污染的鸡肉样品中Y.enterocolitica的初始浓度为4.6×107CFU/g。本研究采用热裂解法对人工污染的鸡肉进行Y.enterocolitica基因组DNA的提取，采用实时荧光LAMP检测人工污染鸡肉中的Y.enterocolitica见图4。

从图4中可以看出，当Y.enterocolitica纯培养物浓度为4.6×105CFU/g~4.6×101CFU/g时，荧光曲线出现明显的扩增峰，仪器自动判定为阳性；当浓度为4.6×100CFU/g时，荧光曲线平缓，未出现扩增峰，判定为阴性。因此，本研究所建立实时荧光LAMP检测人工污染鸡肉的检出限为46 CFU/g。

3 讨论

Y.enterocolitica致病性比较强，人感染后可引起肠胃炎、呼吸系统、心血管系统等疾病，甚至引起急性阑尾炎、败血症[14-15]，因此，建立灵敏、快速检测Y.enterocolitica的方法对于该菌的溯源和控制具有重要的现实意义。目前，Y.enterocolitica的传统检测方法主要以国家标准为依据，该方法的检测周期在5 d~7 d左右，存在着检验周期长，工作量大，灵敏度低等缺点[16]，不能满足日益增长的检测需求。近年来，随着分子生物学的不断发展，人们建立了多种快速检测方法，如PCR法、实时定量PCR法、LAMP方法、RCA方法等检测方法，此外还有免疫学检测方法等。姜英辉等[9]建立了RCA技术检测Y.enterocolitica的方法，灵敏度为1.7×102CFU/mL。其中LAMP技术因具有特异性高、灵敏度高等优点，而被普遍应用于微生物的检测领域。

本研究中所建立的实时荧光LAMP方法在LAMP技术的基础上，向体系中添加荧光染料，通过观察是否有峰图出现就可知道反应是否发生，比普通的LAMP方法省时省力。该方法在结果出现后可直接终止反应，既节省时间又降低了试验成本，同时避免了繁琐的电泳。LAMP引物的设计是针对靶基因上6个特定区域而设计的4条引物，确保了扩增产物的特异性。但在实际操作时需要注意预防污染，避免假阳性结果的出现。

研究结果表明，实时荧光LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为61 CFU/mL，人工污染鸡肉的检出限为46 CFU/g，实现了对Y.enterocolitica高效快速的检测，因此，本研究探索了一种特异性强、灵敏度高的检测Y.enterocolitica的方法，为Y.enterocolitica的快速检测开辟了新途径，适合在基层检测机构推广应用。

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