周至县猕猴桃根结线虫种类鉴定

刘晨+王晨光+张锋+陈志杰+李英梅+张淑莲

摘要 通过形态学鉴定方法及PCR鉴定方法对周至县猕猴桃根部采集的根结线虫进行了种类鉴定。结果表明，感染周至县猕猴桃的病原线虫种类为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。

关键词 猕猴桃；根结线虫；种类鉴定；陕西周至

中图分类号 S436.67 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）02-0117-02

Identification of Root-knot Nematode on Actinidia chinensis in Zhouzhi County

LIU Chen 1 WANG Chen-guang 2 ZHANG Feng 1 CHEN Zhi-jie 1 LI Ying-mei 1 ZHANG Shu-lian 1 *

（1 Bio-Agriculture Institute of Shaanxi，Xi′an Shaanxi 710043； 2 Agriculture Department of Shaanxi Province）

Abstract We used morphological and PCR identification methods to determine the species of root-knot nematodes which occurred on the root of Actinidia chinensis.The samples were collected from Zhouzhi County of Shaanxi Province.The results demonstrated that all samples of root-knot nematode belonged to Meloidogyne incognita.

Key words Actinidia chinensis；root-knot nematode；species identification；Zhouzhi Shaanxi

根結线虫（Meloidogyne spp.）是植物寄生线虫的重要类群，在世界范围内广泛发生，其寄主范围广，常造成作物大面积减产，给农业生产造成巨大损失[1-3]。猕猴桃原产于中国，具有“水果之王”“保健水果”的美誉[4]。周至县是世界公认的猕猴桃原生区，并以其得天独厚的气候、地理优势成为我国猕猴桃的最佳适生区[5]，是闻名全国的“猕猴桃之乡”。2016年，周至县猕猴桃集中连片种植面积已达2.73万hm2，占全国面积的25%、全球面积的18%，年产鲜果49万t，占全国产量的40%、全球产量的15%，猕猴桃已成为周至县的立县产业和农民增收致富的重要产业。随着猕猴桃种植面积的不断扩大，猕猴桃根结线虫病发生越来越重，严重影响猕猴桃的产量。本文通过形态学鉴定和分子生物学鉴定[6]，确定感染周至县猕猴桃的根结线虫种类，从而为果农做好猕猴桃根结线虫的防治工作提供理论依据，为促进猕猴桃产业健康持续发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在周至县采集感染根结线虫的猕猴桃病根。取样采用分区随机取样法，共采集8个样点，样品保存在4 ℃ 冰箱备用。

1.2 形态鉴定

将病根洗净后放入蒸馏水中，挑取雌成虫放入滴有45%乳酸的载玻片上，在显微镜下用解剖刀从虫体后部约1/4处轻轻切下。将后部中杂物用针尖轻轻清除干净，使切口向下将后部展开，做成临时装片[7-8]。

1.3 根结线虫PCR电泳检测

用康为世纪公司的基因组DNA提取试剂盒对单头及混合种群的根结线虫进行DNA提取，并以此为模板进行PCR扩增。根据参考文献[9]，设计4对不同引物，见表1。

PCR反应体系：25 μL Premix Taq、5 μL DNA模板、上游和下游引物各2 μL、16 μL ddH2O。PCR反应条件：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃ 变性30 s，56 ℃ 复性30 s，72 ℃ 延伸30 s，30 个循环，72 ℃ 终延伸10 min。取PCR产物5 μL于1% 琼脂糖凝胶（含EB替代物）电泳检测，并记录结果。

2 结果与分析

2.1 病原线虫的形态学鉴定

对采自周至县猕猴桃病根中的根结线虫，随机挑选20头雌成虫进行形态特征观测。由图1可以看出，其会阴花纹线紧密，呈波浪形、椭圆形或近圆形，无明显侧线，背弓较高，背弓顶部圆或平。观察到根结线虫特征与刘维志[10]描述一致，可以确认供试根结线虫为南方根结线虫。

2.2 PCR电泳检测结果

所用的4对根结线虫特异性引物，只有南方根结线虫的特异性引物从供试样品中扩增出了条带，如图2所示。结果表明，感染猕猴桃根结的为南方根结线虫。

3 结论与讨论

根结线虫是世界性防治难题，全世界报道的根结线虫逾80种，中国报道的有58种[10-11]，其中南方根结线虫发生面积最大且为害的蔬菜种类最多，是当今世界上最具破坏性的病原物之一[12]。有研究表明，陕西省20多个县区不同蔬菜根系根结线虫中南方根结线虫占采集点的97.2%，是保护地蔬菜的绝对优势种群[13]，且发生范围逐年扩大，危害不断加重。根结线虫作为猕猴桃生产中的一种灾害，其发生面积和危害程度有逐年扩大和加重的趋势，易造成树势衰弱、抗逆性降低，加剧了猕猴桃溃疡病的发生。明确猕猴桃根结线虫的种类，对建立猕猴桃根结线虫综合防治技术体系以及促进猕猴桃产业可持续发展具有重要作用。

根结线虫种类鉴定通常采用形态学鉴定，即在显微镜下观察雌成虫会阴花纹的特征并做出正确的鉴定。但同一种群间由于寄主和环境条件的差异，形态上也会有所变化[14]，给准确鉴定根结线虫种类带来干扰。随着分子生物学试验方法的不断发展，通过酯酶同工酶电泳法[15]及PCR方法可以从DNA水平上对根结线虫种类的鉴定提供更准确可靠的依据。本研究主要通过对采集的猕猴桃根结线虫进行雌成虫会阴花纹观察，同时结合PCR方法鉴定，首次确定了周至县猕猴桃根结线虫种类为南方根结线虫（Meloidogyne incognita），可为防治根结线虫提供理论依据，为建立猕猴桃根结线虫综合防治技术体系提供借鉴，为保证猕猴桃产业的良好发展提供保障。但有关猕猴桃上南方根结线虫与蔬菜上南方根结线虫的同源性有待进一步研究。endprint

4 参考文献

[1] 谢辉，冯志新.植物线虫的分类现状[J].植物病理学报，2000，30（1）：1-6.

[2] 席先梅，白全江，张庆萍，等.5种生物制剂对设施蔬菜根结线虫防治技术研究[J].植物保护，2015，41（4）：203-207.

[3] POWERS T O，TODD T C，BURNELL A M，et al.The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic marker for nematodes[J].Journal of Nematology，1997，29：441-450.

[4] 黃成，周长春，李伟，等.猕猴桃的营养保健功能与开发利用研究[J].食品科技，2007，32（4）：51-55.

[5] 高慧生，辛剑，田少青，等.周至猕猴桃产业的喜与忧[J].价格与市场，2013（12）：32-34.

[6] 魏学军，杨文香，刘大群，等.植物根结线虫分子鉴定研究进展[J].中国农学通报，2006，22（8）：401-404.

[7] 冯志新.植物线虫学[M].北京：中国农业出版社，2001.

[8] 张靠稳，贾振华.根结线虫会阴花纹的染色方法[J].北方园艺，2008（3）：207-208.

[9] MENG Q P，LONG H，XU J H.PCR assays for rapid and sensitive identify-ication of three major root-knot nematodes，Meloidogyne incog-nita，M.javanica and M. arenaria[J].植物病理学报，2004，34（3）：204-210.

[10] 刘维志.植物线虫志[M].北京：中国农业出版社，2004.

[11] 廖金玲.根结线虫的种类及其致病性研究[D].广州：华南农业大学，2000.

[12] TRUDGILL D L，BLOK V C.Apomictic，polyphagous root knot nemato-des：exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens[J].Annual Review of Phytopathology，2001，39：53-77.

[13] 张锋，张彦龙，洪波，等.陕西设施蔬菜根结线虫的种类鉴定及分布[J].西北农业学报，2011，20（12）：178-182.

[14] 赵雷，郭恺，洪文英，等.浙江省蔬菜上2中根结线虫的形态学鉴定[J].浙江大学学报，2010，36（6）：623-629.

[15] ESBENSHADE P R，TRIANTAPHYLLOU A C.Isozyme phenotypes for the identification of meloidogyne species[J].Journal of Nematology，1990，22（1）：10-15.endprint