预防性回肠造口联合盆腔冲洗引流对大鼠直肠吻合口愈合的影响＊

谢小平 ，郭仪 ，李现才 ，陈任生 ，朱国民 ，揭志刚

(南昌大学第一附属医院，1.胃肠外科；2.病理科，南昌 330006)

直肠吻合口瘘是直肠癌术后最常见的并发症之一，严重地影响了患者术后临床转归，如何有效地预防和治疗直肠癌术后吻合口瘘一直为临床亟待解决的重要课题。预防性末端回肠造口是目前临床上用于预防和治疗直肠吻合口瘘的常用方法，研究显示[1，2]，预防性末端回肠造口可有效地降低低位直肠癌术后吻合口瘘的发生率和再手术率；但是，也有学者[3]认为预防性回肠造口不仅不能预防直肠吻合口瘘的发生，而且有可能增加术后并发症的风险。因此，对预防性回肠造口在直肠吻合口愈合中的作用迄今仍有争议，为此，本课题对此进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用健康雄性SD大鼠36只，鼠龄 8-10 周，体重（220±20）g，购自南昌大学医学院动物科学部；动物实验经医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂和仪器 注射用戊巴比妥钠粉针（上海新亚药业有限公司），羟脯氨酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所)，Van Gieson染色液（北京索莱宝科技有限公司），医用水银血压计（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司），722型分光光度计 （上海光学仪器厂），光学显微镜 （日本，Olympus），美国双杰电子天平（上海垒固仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型 全部大鼠随机分为4组，每组15只大鼠，组内再按术后3d、7d和10d处理不同分为3小组，每小组各5只大鼠。全部大鼠术前禁食12h后称重，以2%苯巴比妥钠溶液(60mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部剃毛、消毒、铺巾，取下腹长约2cm的正中切口进入腹腔：⑴观察组：切断直肠后用0号丝线对端吻合，吻合口旁置自制的双套管一根，自腹壁引出固定；再距回盲部约2cm切断小肠，远端封闭，近端外置肠造口。⑵肠造口组：方法同上，于吻合口旁注入1ml生理盐水，不置腹腔引流管。⑶非肠造口组：切断直肠后吻合。⑷肠瘘组：直肠吻合时预留约0.3cm不吻合，次日行回肠造口和放置腹腔引流管冲洗。术后全部大鼠自由饮水，12h后少量进食，术后1d用生理盐水负压冲洗腹腔双套管至清亮，每天2次，共3d。

1.2.2 指标观察和方法 观察大鼠术后活动、精神状态、肛门或肠造口排粪、引流管引流通畅等情况，按处理时间点剖腹，检查大鼠腹腔粘连和吻合口愈合程度，切取吻合口两侧约3cm肠襻，剪除周围粘连脂肪组织，清洗后，一端肠管用丝线结扎，另一端插入无针头的头皮针导管并结扎，与去除袖带的血压计气管相连，肠襻置于生理盐水中，缓慢充气，若见水中气泡，记下水银柱刻度即为吻合口破裂压。切取术后3d、7d和10d各处理时间点大鼠肠吻合口及1cm的肠襻，置-60℃保存。按羟脯氨酸检测试剂盒说明书操作，精确称取吻合口肠壁100mg，剪碎，匀浆，加入碱水解液、水浴，调节pH值至 6.8，加入蒸馏水至4ml和活性炭，以3500r/min离心，取上清液1ml为实验液，以蒸馏水为空白管、5μg/ml标准羟脯氨酸液为标准管，分别依次加入氯胺T、过氯酸和对二甲胺基苯甲酸各0.5ml，混匀、置 60℃水浴 15min后，离心，分别取上清液于550nm处，1cm光径，测各管OD值。按公式计算组织羟脯氨酸含量：羟脯氨酸含量（μg/mg湿重）=（实验管OD值-空白管OD值）/（标准管OD值-空白管 OD 值）×标准品含量 （5μg/ml）×水解液体积(ml)/组织湿重（mg）。⑷病理学检查 切取吻合口组织，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察吻合口组织炎性细胞浸润情况；另取石蜡切片，采用Van Gieson染色法[4]行胶原染色，光镜下观察并拍照，观察组织胶原纤维含量和分布。染色判断：胶原纤维呈鲜红色，肌纤维和红细胞为黄色，细胞核为蓝黑或灰色。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计分析软件进行统计分析，全部数据以（x±s）表示，计量资料采用F检验，两两比较采用 Student检验，P＜0.05，具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 60只大鼠术后死亡3只，其中，观察组1只，死于手术当日下午，肠瘘组2只，术后次日发现死亡，死亡原因可能与麻醉和手术创伤有关；死亡大鼠及时补做。其余大鼠均成活，进食、饮水正常、精神灵敏、活跃；术后2h小肠造口或肛门开始排粪；引流管冲洗通畅；术后3d、7d、10d剖腹，观察组、肠造口组及肠瘘组腹腔及吻合口旁粘连明显，非肠造口组腹腔粘连较轻，无积液。

2.2 吻合口破裂压的变化 术后各组随时间延长吻合口破裂压均逐渐增加（P<0.05）；而在术后3d、7d、10d，观察组的吻合口破裂压虽高于肠造口组和非肠造口组，但两者比较并无统计学差异（P>0.05），但明显高于肠瘘组(P<0.05)。见表1。

表1 术后各组吻合口破裂压的变化（x±s，mmHg）

2.3 组织羟脯氨酸含量的变化 术后各组吻合口组织羟脯氨酸的含量随时间的延长而增加 （P<0.05）；而在术后 3d、7d、10d，观察组组织羟脯氨酸含量分别与肠造口组和非肠造口组比较均无明显差异（P>0.05），但较肠瘘组明显升高（P<0.05）。

表2 术后各组肠吻合口的组织羟脯氨酸含量变化（x±s，μg/g）

2.4 病理变化 光镜下观察，术后3d，各组黏膜下层炎症细胞浸润数量较多，其中，肠瘘组明显，其次为非肠造口组和肠造口组，观察组最少；术后7d各组炎症细胞浸润明显减轻，但是，肠瘘组仍较多，而至术后10d，各组基本上无明显炎症细胞浸润。Van Gieson胶原染色显示：术后3d，各组染色胶原较少，其中，肠瘘组染色胶原稀疏；而至术后7d和10d，各组染色胶原逐渐增加，观察组染色胶原增多，其次为肠造口组和非肠造口组，而肠瘘组最少，且分布较杂乱（见图1）。

图1 红色为胶原纤维，蓝色为炎症细胞

3 讨论

保肛手术是低位直肠癌根治性手术患者的迫切要求，但是，术后较高的直肠吻合口瘘的发生率是一直困扰临床的难题之一[5]。自2007年瑞典学者Matthiessen P等[6]首次报告预防性肠造口可以有效地降低低位直肠癌术后吻合口瘘的发生率以来，预防性肠造口术已在临床上被广泛应用，但是，对其预防术后直肠吻合口瘘的作用也一直存在争议[7-11]。有研究[12，13]认为预防性肠造口能明显降低高危人群直肠吻合口瘘的发生率和再手术率以及吻合口瘘相关的死亡率，但也有研究[7]认为预防性肠造口不仅不能降低术后直肠吻合口瘘的发生率，反而会延缓了患者术后康复，增加了术后肠梗阻、腹腔感染和肠穿孔等并发症的发生率。本研究发现：60只大鼠除术后3只发生与手术相关的死亡外，其余成活的大鼠中，除肠瘘组外，另外3组大鼠均无一例出现吻合口瘘，但是，观察组、肠造口组及肠瘘组大鼠术后腹腔及吻合口处小肠和网膜粘连致密，而非肠造口组腹腔粘连较轻，提示：预防性回肠造口有增加大鼠术后腹腔粘连及肠梗阻的风险。

肠吻合口的愈合涉及到肠黏膜上皮细胞迁移和分化、新生血管的生成和基质胶原合成等多个环节，其中，胶原合成量在肠吻合口愈合中起重要作用。肠吻合口的胶原主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原，并经胶原酶和明胶酶作用降解；研究表明[14]：肠吻合后3h即开始合成胶原，并逐渐增加，至第4周恢复正常，并同时伴随有胶原的降解。肠吻合口愈合的强度则取决于胶原合成和降解的平衡；肠吻合口破裂压则是评估吻合口愈合强度的重要指标，而测定组织羟脯氨酸的含量可反映组织愈合过程中胶原合成情况[15]。研究表明：腹腔感染是影响肠吻合口羟脯氨酸合成的重要因素。Thornton等[16]研究发现：与对照组比较，腹腔感染后大鼠，结肠吻合口于术后24h胶原合成量明显下降，96h后恢复正常。本研究发现：各组大鼠随着术后时间的延长，肠吻合口破裂压也逐渐增加，但肠瘘组的吻合口破裂压始终低于其它3组（P<0.05），其组织羟脯氨酸含量也相应地明显降低（P<0.05）；观察组的吻合口破裂压分别与肠造口组和非肠造口组比较并无显著差异（P>0.05），并且，其组织羟脯氨酸含量也较肠造口组和非肠造口组无统计学差异（P>0.05），其原因可能为肠吻合口瘘引起腹腔严重感染，抑制了吻合口组织羟脯氨酸的合成[17，18]，致使吻合口组织愈合延迟；而预防性回肠造口术后早期转流粪水及减轻吻合口肠腔张力，减轻了局部感染，有利于组织胶原的合成和分泌[16-19]。非肠造口组尽管术后早期吻合口有粪水聚积诱发吻合口炎的风险，但是，其炎症反应程度较轻，吻合口胶原的合成可能并未被抑制，致使其吻合口破裂压与肠造口组比较并无明显差异，提示，术中预防性肠造口相对于非保护性肠造口可能在预防直肠吻合术后吻合口瘘的发生方面并无明显优势。

本研究光镜下观察也发现，术后3d，各组大鼠肠吻合口均存在不同程度的炎症细胞浸润，其中，肠瘘组的黏膜下炎症细胞浸润最多，其次为非肠造口组、肠造口组，观察组最少；但是，随着术后时间的延长，各组大鼠吻合口炎症细胞浸润程度也逐渐减轻，至术后10d，各组基本恢复正常；采用Van Gieson染色法对各组大鼠吻合口组织胶原染色研究显示，随着术后时间的延长，吻合口胶原的含量也逐渐增多；在术后3d，各组吻合口胶原含量均较少，而至术后7d和10d，观察组的胶原含量最多，肠瘘组最少，并且，胶原分布较杂乱或呈束状；这些病理变化说明，吻合口组织的炎性反应程度可能是影响组织胶原合成和分泌的重要因素，采用预防性肠造口虽然有可能减轻直肠吻合口的炎症反应，但是相对于非肠造口的大鼠，并不能预防术后吻合口瘘的发生，反而有增加了术后腹腔粘连的风险[20]，提示直肠吻合口瘘的发生可能还与其它的病理因素有关。