两种高效液相色谱法测定双黄连注射液中连翘苷含量的比较研究*

章荣叶，罗成江，汤赛飞，王彬，陈晓林，林仙军

（1.台州市屠宰管理所 浙江台州318000；2.浙江省兽药饲料监察所 杭州 311101；3.浙江建安检测研究院有限公司 杭州 310006）

双黄连注射液由金银花、黄芩和连翘三味中药材制成，主要含有绿原酸、黄芩苷和连翘苷等有效成分[1]。兽医临床用于预防和治疗畜禽外感风寒所致的上呼吸道感染[2]、急性支气管炎[3]、急性扁桃腺炎[4]和轻型肺炎等[5]。目前，该质量标准收载于《兽药质量标准》2017年版（中药卷）[6]。标准采用薄层色谱法鉴别绿原酸、黄芩苷和连翘，采用HPLC法测定黄芩苷的含量，未对连翘苷进行质量控制。目前，连翘苷含量测定的高效液相色谱方法主要有荧光检测法[7]和紫外法[8-11]。因此，本文对连翘苷检测的两种方法进行了比较研究，然后利用建立的方法进行实际样品检测，为完善双黄连注射液的质量控制积累数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

连翘苷对照品购于中国食品药品检定研究院，批号110821-201213，含量95.3%；双黄连注射液，规格为10mL，批号为 20180801、20180802、20180803等3批。乙腈、甲醇均为色谱纯，德国默克公司；磷酸、三乙胺和磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。

Agilent 1260高效液相色谱仪，配VWD检测器（美国Agilent公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Waters 2695-2475高效液相色谱仪（配Empower 2软件）；梅特勒-托利多METTLER TOLEDO XS-205电子天平（精度为0.01mg）。

1.2 高效液相色谱-荧光法

1.2.1 对照品溶液和供试品溶液的配制 取连翘苷对照品适量，加50%甲醇溶液配制成每1mL中含连翘苷约1μg/mL的溶液，为连翘苷对照品溶液；取双黄连注射液1.00mL，于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀释，定容；再取该溶液5.00mL，于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀释，定容，过0.45μm有机滤膜，上机测定。

1.2.2 液相色谱参考条件 色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；荧光检测条件为激发波长277nm，发射波长315nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；流动相：乙腈-水（25∶75，v∶v）。

1.3 高效液相色谱-紫外法

1.3.1 对照品溶液和供试品溶液的配制 取连翘苷对照品适量，加50%甲醇溶液配制成每1mL中含连翘苷约100μg/mL的溶液，为连翘苷对照品溶液；取双黄连注射液1.00mL，于5mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀释，定容，过0.45μm有机滤膜，上机测定。

图1 对照品溶液（浓度为1μg/mL）色谱图（荧光检测器）

图2 供试品溶液（批号为20180101）色谱图（荧光检测器）

图3 对照品溶液（浓度为1 µg/mL）色谱图(紫外检测器）

1.3.2 液相色谱参考条件 色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；检测波长278nm，柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；流动相：乙腈-水（25∶75，v∶v）。

2 结果与分析

2.1 荧光检测条件的确定

荧光检测条件的确定及扫描方法参考文献[12]，首先将仪器的激发波长设定为200nm，发射波长扫描范围为210~800nm，扫描后发现发射波长在277nm处有最大吸收；因此，将277nm的波长作为发射波长固定下来，做激发波长的扫描，扫描结果发现激发波长在315nm处有最大吸收。因此确定荧光检测条件为激发波长277nm、发射波长315nm。

2.2 色谱柱的选择

分别对Waters Symmetry C18、Waters Atlantis C18和Agilent ZORBAX Extend-C18等三种色谱柱进行检测，结果这三种色谱柱都可以用于连翘苷的检测。

2.3 流动相的选择

比较了磷酸盐缓冲液-乙腈、磷酸溶液-乙腈和水-乙腈体系，结果发现水-乙腈流动相体系连翘苷峰型最好、灵敏度最高。优化配比，使连翘苷获得最佳保留时间，最终确定流动相为乙腈-水（25∶75，v∶v），流速为1.0mL/min。

2.4 线性考察、检测限和定量限

取标准系列工作溶液进样检测，以峰面积Y对浓度X（μg/mL）作标准曲线。荧光检测法得出回归方程为Y＝6.72×105X-2.36×104， 相 关 系 数 R2为0.9999， 在 0.01~10.0μg/mL 的浓度范围内呈良好的线性关系；紫外检测法得出回归方程为Y＝3.66×105X+1.06×104，相关系数R2为 0.9999， 在 1~200μg/mL 的浓度范围内呈良好的线性关系。

表1 两种方法测定双黄连注射液中连翘苷含量结果比较（n=3）

图4 供试品溶液（批号为20180101）色谱图（紫外检测器）

2.5 高效液相色谱结果分析

按照上述方法测定，典型色谱图见图1-4。

2.6 两种方法结果比较

对高效液相色谱-荧光检测法和高效液相色谱-紫外检测法的结果进行比较，每批3次测定相对标准偏差均在3.0%以内，两种方法含量测定平均值的相对偏差在3.0%以内，表明结果无显著差异。

3 结论

试验结果表明，荧光法和紫外法测定双黄连注射液中连翘苷的含量，结果无显著差异，两种方法都可以用于连翘苷的测定，荧光检测法响应较高，不易受杂质干扰，对于低含量、杂质较多的样品，影响因素较少，抗干扰强；紫外法响应低，易受杂质干扰，误差较大。■