微小RNA-17在幽门螺杆菌相关胃癌组织中的表达变化及意义

朱艳丽，杜井峰，苏德望，刘亮，程卓鑫，张雪梅

(1佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002；2佳木斯市肿瘤医院)

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率与病死率均居所有恶性肿瘤的前三位[1]。胃癌的病因尚不完全清楚，目前认为幽门螺杆菌(Hp)感染与胃癌的发生、发展密切相关，而且WHO已将其列为Ⅰ类致病原[2]。Hp感染在诱导胃黏膜细胞发生炎症反应时，可刺激或抑制微小RNA(miRNA)基因表达，有可能作为抑癌基因或促癌基因参与胃癌的发生、发展[3,4]。细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白是Hp Cag致病岛上CagA基因编码的产物，亦是Hp感染导致宿主炎性反应的重要效应蛋白。微小RNA-17(miR-17)可作为促癌基因参与脑胶质瘤、结肠癌细胞增殖、侵袭、转移[5,6]。但其在胃癌组织特别是Hp阳性胃癌组织中的表达变化鲜见报道。2016年1月～2017年9月，本研究观察了miR-17在Hp相关胃癌组织中的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集同期就诊于佳木斯大学附属第一医院的胃癌患者75例，均经病理检查确诊，其中Hp阳性48例、Hp阴性27例。48例Hp阳性胃癌患者中，男30例、女18例，年龄>60岁16例、≤60岁32例；肿瘤直径：≤5 cm 28例，>5 cm 20例；组织分化程度：中度14例，低度34例；临床分期(国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会第8版)[7]：Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期20例；Borrmann分型：Ⅰ、Ⅱ型26例，Ⅲ、Ⅳ型22例；有淋巴结转移21例，无淋巴结转移27例。本研究经佳木斯大学附属第一医院医学伦理委员会批准，患者或其家属均知情同意。

1.2 细胞毒素相关基因A(CagA)mRNA表达检测 取手术切除的胃癌组织标本，常规固定、脱水、包埋、切片、染色，采用实时定量PCR法检测CagA mRNA表达。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。正向引物：5′-GATAACAGGCAAGCTTTGAGG-3′；反向引物：5′-CTGCAAAGATTGTTTGCGAGA-3′。总DNA提取：取胃癌组织标本，石蜡块切片，经二甲苯脱蜡，使用消化液消化，采用酚-氯仿提取DNA。按PCR试剂盒说明配制反应体系。反应条件：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性60 s、50 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s共30个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算CagA mRNA相对表达量。

1.3 miR-17表达检测 总RNA提取：取胃癌组织及癌旁组织(距肿瘤组织边缘>10 cm)标本，于液氮中碾磨成粉状，根据TRIzol说明提取组织总RNA，使用DEPC处理后蒸馏水溶解。经Biophotometer分光光度计鉴定，A260/A280为1.8～2.0，说明提取的总RNA浓度与纯度合格。按反转录试剂盒说明将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。按PCR试剂盒说明配制反应体系。反应条件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-17相对表达量。

2 结果

2.1 Hp阳性、阴性胃癌组织CagA mRNA表达比较 Hp阳性、阴性胃癌组织CagA mRNA相对表达量分别为6.061±0.712、1.024±0.235。Hp阳性胃癌组织CagA mRNA相对表达量高于Hp阴性胃癌组织(t=35.593,P<0.05)。

2.2 Hp阳性、阴性胃癌组织miR-17表达比较 Hp阳性胃癌组织、癌旁组织miR-17表达均高于Hp阴性胃癌组织及癌旁组织(P均<0.01)；Hp阳性、阴性胃癌组织miR-17表达高于癌旁组织(P均<0.01)。见表1。

表1 Hp阳性、阴性胃癌组织及癌旁组织miR-17表达比较

注：与Hp阴性比较，*P<0.05；与癌旁组织比较，#P<0.05。

2.3 miR-17表达与Hp阳性胃癌患者临床病理特征的关系 不同性别、年龄、组织分化程度Hp阳性胃癌患者miR-17表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；肿瘤直径>5 cm，临床分期Ⅲ、Ⅳ期，Borrmann分型Ⅲ、Ⅳ型以及有淋巴结转移者miR-17表达高于肿瘤直径≤5 cm，临床分期Ⅰ、Ⅱ期，Borrmann分型Ⅰ、Ⅱ型以及无淋巴结转移者(P均<0.05)。见表2。

表2 miR-17表达与Hp阳性胃癌患者临床病理特征的关系

2.4 胃癌组织miR-17表达与CagA表达的关系 胃癌组织miR-17表达与CagA表达呈正相关关系(r=0.564,P<0.01)。

2.5 miR-17表达与Hp阳性胃癌患者预后的关系 根据miR-17表达差异，以差异大于2倍为分界点将Hp阳性胃癌患者分为高表达30例和低表达18例。miR-17高表达Hp阳性胃癌患者生存时间为(27.65±4.12)个月，miR-17低表达Hp阳性胃癌患者生存时间为(34.74±5.32)个月。miR-17高表达Hp阳性胃癌患者平均生存时间明显短于miR-17低表达Hp阳性胃癌患者(t=5.170,P<0.05)。

3 讨论

miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，具有高度保守性、时序性与组织特异性，在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用。因miRNA的结构稳定、不易被降解，被认为是具有广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于肿瘤早期筛查、预后判断[8，9]。miR-17定位于人13号染色体，属于miR-17-92基因家族一员，在宫颈癌[10]、胆管癌[11]、食管癌[12]等组织或患者血清中高表达，可能作为一种促癌基因，参与肿瘤的发生、发展[13，14]。

Hp为单级、多鞭毛、螺旋形弯曲的革兰阴性菌，能分泌毒力因子，可寄居于胃黏膜表面，能刺激胃黏膜炎症、免疫反应。Hp致病性取决于细菌毒力因子与宿主细胞应答等相关因素[15，16]。CagA蛋白是Hp Cag致病岛上CagA基因编码的产物，亦是Hp感染导致宿主炎性反应的重要效应蛋白，可引起胃黏膜慢性炎症损伤，增加胃癌发生风险[17]。马连君等[18]研究报道，Hp阳性胃癌组织CagA mRNA表达高于Hp阴性胃癌组织。本研究结果与之相符，并发现胃癌组织miR-17表达与CagA mRNA表达呈正相关关系。本研究还发现，Hp阳性胃癌组织、癌旁组织miR-17表达高于Hp阴性胃癌组织及癌旁组织，Hp阳性、阴性胃癌组织miR-17表达高于Hp阳性、阴性癌旁组织，提示Hp感染可诱导刺激miR-17表达。

有研究表明，miR-17可通过p21p、53INP1等途径诱导胃癌细胞增殖并抑制其凋亡[19]，但这种作用在不同病理特征患者中效果各不相同[20，21]。本研究结果表明，Hp阳性胃癌患者miR-17表达与肿瘤直径、临床分期、Borrmann分型、淋巴结转移有关，与姜双等[22]报道类似。本研究还发现，miR-17高表达者Hp阳性胃癌中患者生存时间明显短于miR-17低表达Hp阳性胃癌者，说明miR-17可能参与Hp相关胃癌的发生、发展。

综上所述，miR-17在Hp相关胃癌组织中的表达异常升高，且与肿瘤直径、临床分期、Borrmann分型、淋巴结转移及患者预后有关。miR-17有可能作为Hp相关胃癌早期诊断及预后判断的候选标志物。