微流控技术在体外细胞转运系统中应用的研究进展

李　波，王远萍，段浩博，刘可可，唐思嘉，周　乐，孙宏晨

(吉林大学口腔医院实验教学中心，吉林 长春 130021)

微流控是一种以微组装结构为基础并在显微尺度处理流体的操作技术，其具体操作是处理低体积流体以实现自动化和高通量筛选，通常在亚毫米的规模对流体实施精确的控制和操纵，流体被移动、混合、分离或以其他方式处理。近年来,微流控技术在医学的应用日渐展现其独特贡献，电穿孔、热偏差与流体剪切应力相继应用于微流控系统设计。微流控技术与传统膜中断技术结合为新一代细胞转运系统的建立提供了新思路。本文作者以细胞的体外转运系统为例，综合阐述微流控技术与传统膜中断技术结合的具体机制，归纳研究现状及尚未解决问题，为微流控体外细胞转运系统提供一个较为全面和详细的框架。

1　微流控技术

20世纪60年代初集成电路的发明实现了小型化、微电子的影响潮流，集成电路的微加工技术缩减了流体系统形成第1代系统——气相色谱法(gas chromatography，GC)[1]。20世纪80年代初形成微流体学，用于喷墨打印头、DNA芯片、芯片实验室技术、微推进和微热技术的开发。20世纪90年代，微型机械系统开始应用于微流体学[2]。源于半导体工业的微流控技术，吸纳微机电系统(MEMS)自成一体，经常被称为微型全分析系统(μTAS)或芯片实验室装置[3]。微流控是一种以微组装结构为基础在显微尺度处理流体的操作技术[4]。微流控装置的核心元素为微孔道、室和阀门，用以完成严格复杂的操作[4]，其原理包括微量流体层流、低扩散率、流体表面效应以及电动力学[1]。由于样品处理快、用量小、流体分析时控制精确，大幅度减少了样品和试剂的损耗量，微流控技术迅速取代了传统的实验操作[3]，成为备受瞩目的新技术。微流控应用于化学、工程、生物和药品等众多领域。微流控在生物医学的应用主要包括以下几个方面[4]：分子水平的核酸、蛋白质分析；细胞水平研究细胞力学、细胞迁移、细胞分离、细胞分类还有单个细胞分析；材料转运；仿生设计的材料转运和药物投递芯片。

2　体外细胞转运系统

2.1传统的膜中断技术除了载体介导的核酸转染转运系统[5]，基于膜中断技术的体外转运系统也备受关注[6]。膜中断技术主要应用物理方法例如机械、电击、热力、光学和化学因素使细胞膜形成暂时的断裂[6]，使转运物质直接穿透细胞膜进入细胞。以下为几种传统的膜中断方法：化学方法包括膜活性肽、洗涤剂和穿孔毒素[7]；机械中断方法如高速粒子穿透作用、流体剪切应力作用[8]和静水压/渗透压的压力作用[9]；显微注射法[10]；热偏差法[6]；电穿孔等。传统的膜中断技术有3个明显不足[6]：①传统的膜中断技术会造成细胞膜不同程度的损伤，损伤程度小阻碍纳米颗粒的有效投递，损伤程度大导致细胞损伤；②吞吐量和可伸缩性(如显微注射)差；③细胞恢复不充分，导致细胞死亡。例如热击和电击将导致蛋白质失活和细胞损伤。而近年来，通过微流控操作剂微流控平板或微流控芯片实现的膜中断技术有效地弥补了传统膜中断技术的不足。细胞的材料转运尤其强调基于膜中断技术的投递方法以及纳米技术、微流控和实验室芯片技术在该领域的应用。

2.2新一代体外转运系统新一代转运系统的建立对基于细胞治疗和基因编辑的再生医学和基础生物学十分必要[6]，临床试验中基于体外细胞治疗的有效案例主要包括造血干细胞[11]和T细胞的免疫治疗[12]。基因编辑可应用于抗肿瘤免疫治疗[13]。向多种细胞转运多种不同材料是新一代转运系统面临的主要挑战[6]。相对于传统转运系统，新一代转运系统主要有4个特点：①改进了传统转运系统，细胞损伤小；②极大地提高了转运效率和吞吐量；③为细胞靶向物质转运提供了新思路；④安全性高，体外物质转运对临床应用具有借鉴意义。

3　微流控在基于膜中断技术的体外转运系统中的应用

3.1 微流控与电穿孔结合与传统的整体电穿孔不同，通过微流控装置实现的电穿孔技术根据细胞的规模定位电击领域，进而降低电压(传统方法所需为100 V)、提高热量耗散速率[14]，降低对细胞的损伤并且极大地提高了转运效率[15]。恒定直流电压可以造成水流中细胞电穿孔，Geng等[16]进行如下设计使恒定电压的强度和频率根据细胞流动时收缩程度变化，主通道设置一部分收缩部，脉冲强度由主通道和收缩部之间的横截面比决定，而频率有细胞流过的速度决定。根据不同类型细胞的直径确定收缩部的管道直径和水流速度，选择适合的电压强度和频率。Garcia等[17]设计了一个微流控系统提高了细菌细胞电转运的效率和吞吐量，微流控装置非均一收缩的微管道使相对较小的电压形成了一个高电流区域。流体动力学的介入，比之传统电穿孔方法，转运效率提高了4倍，吞吐量提高了100～1 000倍。对比于传统的操作技术，微流控技术的应用为新一代细胞投递系统提供了新思路。

3.2微流控与热偏差法结合传统的热偏差法虽然能够实现细胞内的材料投递，但会严重损伤细胞功能。微流控装置为局域或部分实行热中断技术提供了可能。实际上，热喷墨打印机处理的细胞溶液证明了基因转染的成功，但不清楚细胞的膜中断实现是源自喷嘴处的流体剪切效应，还是温度尖峰或两者均有[18]。由高聚焦超声热触发的药物释放已经成为一种重要的药物投递方法，这种方法根据脂质对温度敏感的特点，能够将能量聚焦于一定区域从而减少对细胞的损伤。当携带药物的脂质体随血液循环到达患处，高聚焦超声热触发使患处细胞通透性增加，实现靶向给药[19]。Meng等[19]建立了一个微流控模型探讨其机制，微流控装置由40对环形电极组成，镶嵌在1 mm厚、128°Y旋转和X传播的LiNbO3基板上，并由单相位单向换能器操控。微流控装置中央放置一个材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微型细胞培养皿保证温度不变，小鼠乳腺癌细胞通过聚-L-赖氨酸黏附在PDMS表面，加入封装多柔吡星的脂质体。该实验检测细胞温度、应力变化并阐明其作用机制，结果显示：低熔点的脂质在热能作用下通透性发生变化，声波辐射力使细胞膜损伤。虽然已有以上研究，但热偏差法的作用机制仍未完全解决。

3.3 微流控与纳米芽膜结合纳米芽管作为生物分子向细胞内转运的通道确保持续的物质释放[20]，Xu等[21]利用纳米芽管转运系统将功能性探针转运到细胞膜内，Xu等[22]将纳米芽膜与微流控结合建立了一个有趣的细胞转运系统。在纳米芽膜表面形成密度为3 × 107cm-2、直径为100 nm的显微孔道，犹如在纳米膜表面建立极密的显微注射针。将纳米芽膜衬于微流控平板培养室底，培养室通过纳米芽膜与其下100 μm深、0.5 mm宽的流体通道相同，当溶有转运物质的流体快速流经显微孔道时，便可通过纳米芽膜的针刺作用完成细胞的物质转运。

3.4微流控与机械力结合机械扰动的膜中断技术主要包括黏附细胞的刮擦和珠粒负载[23]或由小规格针头重复抽吸排出的悬浮液中的细胞[24]。现代微流控技术可以增加机械力的精确度，例如细胞挤压的原理是细胞在通过细胞直径的约一半至三分之一的微流体收缩时快速变形，蛋白质、核酸、量子点、碳纳米管和其他纳米材料已被证明可以通过这种方式递送[25]。Saung等[26]设计了一个微流控装置，在微流控平板的孔道上设置一个收缩部，根据不同类型的细胞直径确定收缩部的孔道直径和孔道长度，细胞通过收缩部时出现暂时的破坏，载体即可进入细胞。

椎板黏度计表面由固体变成液体时可以产生一个确定的剪切应力，能够使单层细胞顶层细胞膜瞬时透化[27]。根据这一现象设计了微流控装置，微流控的微孔道为由直径300 μm渐变为50 μm的锥形孔道，可以根据细胞流速产生相应的剪切应力[28]。但是剪切应力不易重复控制，需辅以微米尺寸的空化气泡[29]，19世纪80年代引入了一种新的渗透化方法[30]，即声波作用可以在溶液中产生空化气泡[31]。然而，最近多个公开的数据集分析表明超声主要对递送具有大于50%效率或50%活性的体外分子具有较好的成果[31]。这归因于随机和剧烈空化的操作机制是异质的，一些细胞经历过度损伤，而其他细胞则不受影响[32-33]。空化气泡的精确定位为靶向空化提供了良好开端。

4　结　语

目前，世界各地研究机构和临床中心使用的细胞内材料递送方法主要为基于病毒载体、脂质体载体和电穿孔等实验方法，这些已建立的方法具有机制复杂、安全性小及其对细胞行为不可预测的影响等缺点，明显地限制了生物实验的范围并降低了潜在有希望的细胞治疗概念的功效。因此，安全有效的细胞投递系统的建立对细胞实验十分重要，并且对细胞治疗和基因治疗等临床应用具有推动作用[6]。近年来，微流控技术在细胞水平和分子水平的应用具有巨大进展。微流控为细胞内的材料以及生物大分子的递送提供了良好平台，尤其是与基于膜中断技术的传统递送方法结合，建立了系统的微流控模型。而且微流控技术为细胞的靶向递送提供了新思路，对于不同类型的细胞已有相应类型的递送材料或生物分子，微流控装置和微流控技术未来极有可能实现向不同系别的细胞投递不同分子的商业化产品。微流控是建立新一代投递技术的重要方法，微流控技术与医学研究的结合及微流控装置在医学的应用值得不断地探索研究。

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