有机肥不同施肥量对茶园土壤微生物区系的影响

赵晓楠， 李玉红， 芦阿虔， 王 岩

(郑州大学化工与能源学院，河南郑州 450001)

茶树是多年生经济作物，喜酸聚铝，因此茶园土壤比较特殊。为了提高茶叶产量，茶农长期大量使用化肥，导致茶园土壤综合肥力下降，茶园土壤生态遭到破坏。土壤是茶树生长发育、营养吸收的重要场所，是一个非常复杂的生态系统。施肥是影响土壤质量及其可持续发展最重要的农业措施之一，在农业生产实践中，施肥技术在土壤肥力、土壤微生物及作物产量和品质方面具有非常重要的影响，而土壤微生物在促进土壤有机质分解、土壤矿质营养循环、维持和提高土壤肥力等方面发挥着关键作用[1]。20世纪90年代以来，关于不同施肥方式对土壤生态系统的影响已有多人进行研究，但是前人对茶园土壤微生物的研究，受研究技术手段所限，大多数仅限于实验室可培养微生物，基于分子生物学的研究尚不多见。由于环境中的微生物只有1%可用传统平板计数法进行分离培养[2-3]，势必会低估土壤微生物的群落结构组成，无法对土壤微生物群落结构及组成进行全面精准的分析。随着分子生物学技术的发展，基于分子生物学的土壤微生物的研究方法，如高通量测序技术解决了微生物不可培养的问题，能够准确地反映土壤微生物群落的丰度和多样性。因此，研究不同施肥制度下茶园土壤微生物区系的特征，可为茶园合理施肥和营造良好的茶树生长环境提供理论支撑。

河南省信阳市是历史名茶信阳毛尖的产地，其茶叶种植面积较大，但在茶叶生产过程中同样存在片面追求产量而忽视土壤质量的问题。鉴于此，笔者在河南省信阳市浉河区浉河港镇的茶园进行大田试验，研究有机肥不同施用量对茶园土壤性质和土壤微生物区系的影响，以期通过合理的施肥措施，实现信阳市茶产业生态、可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取位于河南省信阳市浉河区浉河港镇林场村八里坡组的茶园进行大田试验，供试茶园的生境状况如下：茶树品种为福建大白茶7号，树龄为16年，地理位置为32.026°N、113.849°E，面积为0.5 hm2，海拔为284.3 m，坡向为东坡，坡度为25°，前作为林地。分别于2012年12月、2013年12月和2014年12月进行有机肥表面撒施，茶园按当地习惯进行田间管理，于每年清明节前采取土壤样品进行相关测定。试验设置3个处理：不施肥(CK)、施有机肥1 500 kg/hm2(T1)和施有机肥3 000 kg/hm2(T2)。试验用有机肥养分含量标准：有机质>45%，N+P2O5+K2O>7%。

1.2 样品采集

连续施用有机肥3年后，采用五点取样法对各处理试验田进行土壤样品采集。取0～20 cm土层的土壤，剔除土样中较大的根和石子等杂物，之后将土样中较大的土块捏碎，混合均匀，然后采用四分法，将一部分装入15 mL离心管中冷藏，用于土壤微生物分析；另一部分于托盘中自然风干后磨细，过18、80目筛，用于土壤养分含量的测定。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤养分含量测定方法 土壤pH值的测定采用SPM-10数字式pH计测定，碱解氮含量的测定采用碱解扩散法，土壤速效磷含量的测定采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法，土壤速效钾含量的测定采用乙酸铵提取-火焰光度法，土壤有机质含量的测定采用重铬酸钾-油浴法[4]。

1.3.2 土壤微生物区系测定 土壤微生物区系采用高通量测序技术[5-6]，细菌以16S rDNA作为标记基因，真菌以18S rDNA作为标记基因，测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。

2 结果与分析

2.1 不同处理对茶园土壤养分含量的影响

从表1可以看出，施用有机肥可以提高土壤中有机质、全氮、碱解氮和速效钾含量，对土壤pH值和速效磷含量的影响不大。

表1 供试茶园的土壤养分含量

2.2 不同处理对茶园土壤微生物群落结构组分的影响

2.2.1 不同处理对茶园土壤细菌群落结构组分的影响 从图1中不同处理茶园土壤细菌群落结构组分分析结果可以看出，不同处理茶园土壤所含细菌属的种类和数量均发生了变化。从对照土样中共检测出441个细菌属，总数是14 944个；从T1处理土样中共检测到493个细菌属，总数是8 529个；从T2处理土样中共检测到535个细菌属，总数是9 672个。随着有机肥施用量的增加，检测出的细菌属的种类增加。

在检测出的所有细菌属中，除去未检测到的和未命名的，将各处理细菌属含量排名前10的列出。由表2可知，不同处理的茶园土壤中优势细菌属的种类和数量均有差异，其中数量达到总数2%以上的细菌属，对照有6种，分别为Gp1、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、Gp3、Gp6、芽单胞菌属(Gemmatimonas)和生丝微菌属(Rhizomicrobium)；T1处理中数量达到总数2%以上的有10个属，分别为沙雷氏菌属(Serratia)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、绿脓杆菌(Pseudomonas)、发光细菌属(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)、戴尔福特菌属(Delftia)、Gp4、铁杆菌属(Ferruginibacter)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)；T2处理土壤中数量达到总数2%以上的有7个属，分别为假单胞菌属(Pseudomonas)、Gp4、Gp1、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、发光细菌属(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)和芽孢杆菌属(Bacillus)。

表2 不同处理土壤中优势细菌属含量及占比

由表2还可以看出，不同处理茶园土壤优势菌属种类及其占比均发生了变化。与对照相比，施用有机肥数量增加的细菌有芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、发光菌属和黄色杆菌属等。其中，乳酸杆菌属于厌氧性微生物，关于乳酸杆菌的应用在畜牧业和医学上已有很多人进行研究[7-8]，但是其在农业方面的应用研究很少。发光细菌是一种在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，发光细菌及其发光基因在环境监测等领域中具有广泛的应用价值，可以用来检测土壤毒性[9-11]。黄色杆菌属对农田中的对鳞翅目害虫有很好的防治作用，可用来杀死菜青虫[12]。至于茶园土壤中这些细菌的功能和作用到底是什么尚不得而知，须要进一步探讨与研究。

2.2.2 不同处理对茶园土壤真菌群落结构组分的影响 从图2的不同处理对茶园土壤真菌的群落结构组分的影响可以看出，不同施肥处理的茶园土壤所含真菌属的种类和数量均发生了变化，其中从对照中检测出47个真菌属，总数是5 687个；从T1处理中检测到64个真菌属，总数是86 112个；从T2处理检测到70个真菌属，总数是11 736个。

在检测出的所有真菌属中，除去未检测到的和未命名的，将各处理真菌属数量排名前10的列出，由表3可以看出，占比达到2%以上的真菌属数量作为优势菌属，对照中优势真菌属有4种，分别为粗糙孔菌属(Trechispora)、镰刀菌属(Fusarium)、隐球菌属(Cryptococcus)、被孢霉属(Mortierella)；T1处理有8种，分别为接合菌纲未命名属(unclassified Zygomycota)、镰刀菌属(Fusarium)、隐球菌属(Cryptococcus)、被孢霉属(Mortierella)、原金蝗属(Gongronella)、糙孢孔目-未命名属(unclassified Trechisporales)、红酵母(Rhodotorula)和Umbelopsis；T2处理有8种，分别为隐球菌属(Cryptococcus)、糙孢孔目未命名属(Unclassified Trechisporales)、镰刀菌属(Fusarium)、红酵母(Rhodotorula)、皮司霉属(Guehomyces)、Adisciso、被孢霉属(Mortierella)和Mrakia。

从表3还可看出，不同处理下茶园土壤的优势真菌属种类及其占比均发生了变化。与对照相比，施用有机肥后数量增加的真菌主要有镰刀菌属、隐球菌属和被孢霉属等，从T1、T2处理中均检测到了红酵母。有研究表明，镰刀菌属广泛分布于自然界中，能产生植物刺激素(赤霉素)，可使农作物增产，同时也是一类重要的植物病原菌，能引起许多植物病害，如由禾谷镰刀菌为病原的小麦赤霉病是宁夏小麦的常发性病害[13]；然而，镰刀菌在植物线虫防治方面却有重要作用，而且非致病性镰刀菌还可用来防治镰刀菌病害。壶菌门是高等植物的寄生虫，虽然对植物生长的直接影响不大，但是其游动孢子是传播土壤中一些病毒的介体，研究发现，壶菌门的玉蜀黍节壶菌能引起玉米褐斑病，内生集壶菌能引起马铃薯癌肿病，因此，该菌的减少有助于土壤环境的改善。红酵母是一种腐生菌，可分解多种物质，是天然的清洁工[14]。然而，这些茶园土壤中的优势真菌到底有什么样的功能尚不清楚，如何筛选出具有促生型或抗病型功能的有益菌值得进一步研究。

表3 不同处理优势真菌属含量及其占比

2.3 不同处理对茶园土壤生物多样性的影响

α多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性，计算群落分布丰度(community richness)的指数有Chao指数、ACE指数，这2个指数用来估计群落中OTU(操作分类单元)数。用Shannon指数来计算群落分布多样性(community diversity)，Shannon值越大，说明群落的多样性越高。用各样品文库的覆盖率可以反映测序结果的真实情况。

由表4不同处理对茶园土壤细菌多样性的影响结果可知，在97%分类水平下，不同施肥处理下微生物OTU数量、Chao指数、ACE指数和Shannon指数有所差异。Chao指数的大小顺序为T2>CK>T1；ACE指数的大小顺序为T2>CK>T1；Shannon指数的大小顺序为CK>T2>T1。由此可见，施用有机肥可提高茶园土壤细菌的丰度，但并未提高细菌群落的多样性。

由不同施肥处理对茶园土壤真菌多样性的影响(表5)可知，Chao指数表现为T2>CK>T1，ACE指数表现为T2>CK>T1，Shannon指数表现为T2>T1>CK。以上结果表明，有机肥的施入并不一定会提高真菌的丰度，但对于丰富土壤真菌的多样性是有利的。

3 讨论与结论

目前，高通量测序方法已经成为研究不同地区土壤微生物群落结构及组成的主要方法。刘洋等分析了基于454高通量测序的黄土高原不同乔木林土壤细菌群落特征，结果表明，

表4 不同处理对茶园土壤细菌多样性的影响

表5 不同处理对茶园土壤真菌多样性的影响

不同乔木林土壤中的优势菌来自变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和浮霉菌门(Planctomycetes)，主要优势菌纲为放线杆菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacte ria)、酸杆菌(Acidobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteo bacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)[15]。汪其同等基于高通量测序分析了杨树人工林根际和非根际细菌群落结构的不同，发现根际和非根际相对丰度>4%的属有8个，分别是Acidobacterium、Gp1、Acidobacterium、Gp3、Acidobacterium、Gp6、Gemmatimonas、Bradyrhizobium、Burkholderia、Streptomyces和AcidobacteriumGp4[16]。α多样性分析表明，根际土壤细菌群落多样性高于非根际土壤，但差异未达到显著水平。

施用有机肥对土壤微生物的影响已有很多研究，朱庆松等分析了不同覆盖措施对信阳毛尖茶园土壤微生物量动态变化的影响，结果表明，稻草覆盖处理与白三叶覆盖处理均能增加土壤微生物的数量和活性[17]。朱海平等通过分析不同培肥管理措施对土壤微生物生态特征的影响发现，施入厩肥、化肥或秸杆还田均能明显增加土壤微生物生物量及呼吸量[18]。林新坚等研究表明，施用有机肥可有效改善土壤物理性状，增加土壤微生物总量[19]。王鹏研究发现，有机生物活性肥料能够促进土壤中有益微生物的繁衍，有效提高土壤酶生物活性[20]。单武雄等发现，施用菜籽饼肥加稻草覆盖处理可以显著提高0～20 cm土层的蚯蚓数量和生物量、氨氧化细菌、好气性自生固氮菌、嫌气性自生固氮菌、放线菌、真菌和细菌等物生物数量[21]。温延臣等研究发现，施用有机肥以及有机无机配肥与化肥相比，土壤微生物碳、氮含量分别增加50%～112%、34%～79%，提高了土壤活性养分供应能力[22]。总体来说，施用有机肥可以增加土壤中微生物的数量，但是目前基于高通量测序的方法对土壤微生物群落结构和生物多样性的研究尚不多见。

因此，本试验运用Miseq测序平台研究了有机肥施用量对茶园土壤微生物群落结构和生物多样性的影响，结果表明，增施有机肥可以改变茶园土壤微生物的OTU数量和种类，且随着施肥量增加，茶园土壤微生物的OTU丰度越高。不同施肥处理的茶园土壤所含微生物属的种类和数量都有所差异，随着有机肥施用量的加大，可检测出的细菌和真菌属的种类也变多。