2016—2017年江苏地区弯曲菌流行现状监测

颜 卫， 赵莎莎， 卢劲晔， 羊建平， 沈晓鹏， 蒋珊珊

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

弯曲菌是一种重要的人兽共患病原菌，不仅可以引起动物腹泻、牛羊流产、雏鸡坏死性肝炎，它也是全球范围内引起人胃肠道感染最常见的病原菌，可引起人类发热、急性肠炎、格林巴利综合征等，儿童、老人和免疫缺陷症病人是弯曲菌感染的高危人群，严重时可引起死亡。该菌广泛分布于自然界，是许多畜禽的寄生菌，可通过动物、食物、水等传播并引起人类感染，肉类、蔬菜、水等均存在不同程度的弯曲菌污染，对该菌的流行现状监测对于食品安全、公共卫生有重要意义。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

布氏肉汤、Carry-Blair运送培养基，购自北京陆桥技术有限责任公司；CCDA购自OXOID公司，Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA marker，购自大连宝生物工程公司；微氧产气袋购自MGC公司；绵羊全血购自兰州民海生物工程有限公司。抗生素混合液：多黏菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平各 0.125 g，放线菌酮1.250 g，加入25 mL丙酮蒸馏水混合液(1 ∶1 比例混合)溶解过滤后备用。弯曲菌生长促进剂：硫酸亚铁、焦亚硫酸钠、丙酮酸各称取1.563 g，加入25 mL蒸馏水充分溶解，过滤备用。布氏肉汤高压灭菌，冷却后分别加入抗生素混合液和弯曲菌生长促进剂摇匀备用(200 mL中加入 1 mL)。CCDA配制完高压灭菌后，冷却至50～60 ℃加入头孢哌酮(32 mg/L)和两性霉素B(10 mg/L)。

1.2 样品来源

2016年6月至2017年5月陆续采集医院腹泻病人(包括门诊部和住院部)粪便样本、农贸市场和超市食品样本、环境样本、动物源肛拭样本(包括规模化圈养鸡、散养鸡、市场鸡、养殖场鸭群、养殖场鹅群)共868份进行弯曲菌的检测。

1.3 弯曲菌的分离

肛拭样品、腹泻患者送检的粪便样品插入Carry-Blair运送培养基中于12 h内送实验室检测。食品、环境样品采集后置于4 ℃冰盒送实验室立即检测。取肉类、蔬菜样品1 g剪碎，污水样品1 mL，Carry-Blair培养基中取出的棉拭加入9 mL布氏肉汤(含抗生素和生长促进剂)，厌氧培养罐(加入微需氧产气袋后立即密封)42 ℃摇床培养24 h，菌液接种CCDA平板，42 ℃培养箱(含10% CO2)培养24～48 h，选取湿润、灰白色，有金属光泽菌落3～5个，溶于50 μL超纯水，隔水煮沸20 min后取出置于冰上，8 000 r/min离心5 min，取上清进行PCR检测。

1.4 弯曲菌的鉴定

参照何蕊等的方法[1]，选取弯曲菌属16S rRNA基因、空肠弯曲菌mapA基因、结肠弯曲菌CeuE基因设计引物。PCR体系中各成分的量为：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 3 pmol，16S rRNA的引物分别为20 pmol，mapA引物、CeuE引物各为 37.5 pmol，模板溶液2 μL，Taq酶0.2 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

空肠弯曲菌标准菌株经多重PCR扩增，在857、589 bp处分别出现属特异性条带和种特异性条带；结肠弯曲菌经PCR扩增，在857、462 bp处分别出现属特异性条带和种特异性条带。

2 结果与分析

2.1 人源样本弯曲菌的监测结果

本试验采集的183份腹泻患者粪便样本中有10份检测出空肠弯曲菌，阳性率5.46%，有1份检测出结肠弯曲菌，阳性率0.55%。147份5岁及以下婴幼儿样品中有10份样品检测出弯曲菌阳性，阳性率6.80%，其中9份样品为空肠弯曲菌阳性，阳性率6.12%，1份样品为结肠弯曲菌阳性，阳性率0.68%；36份6岁及以上腹泻患者样品中检测出1份空肠弯曲菌阳性，阳性率2.78%(表1)。6—8月份的68份样品中，检测出6份弯曲菌阳性，阳性率8.82%，其中5份空肠弯曲菌阳性，1份结肠弯曲菌阳性，阳性率分别为7.35%、1.47%，9—11月份采集的56份腹泻患者样品中有4份检测出空肠弯曲菌，阳性率7.14%，12月至第2年2月份的31份患者样品中检测到1份空肠弯曲菌阳性，阳性率3.23%，3—5月份的样品未检测到弯曲菌(表2)。来源于医院门诊的132份样品中，弯曲菌阳性率7.58%，其中空肠弯曲菌阳性样品9份，阳性率6.82%，结肠弯曲菌阳性样品1份，阳性率0.76%，来源于医院住院部的51份样品中，仅1份检测出空肠弯曲菌，阳性率1.96%(表3)。

表1 不同年龄人源样品弯曲菌监测结果

表2 不同时期人源样品弯曲菌监测结果

表3 不同采样地点人源样品弯曲菌监测结果

2.2 动物源样本弯曲菌的监测结果

采集养殖场鸭群样本59份，检测出空肠弯曲菌阳性2份，阳性率3.39%，未检测到结肠弯曲菌。采集养殖场鹅群样本56份，检测出空肠弯曲菌阳性7份，阳性率12.50%，未检测到结肠弯曲菌。224份鸡群样品中，检测出弯曲菌阳性样品33份，阳性率14.73%，其中空肠弯曲菌阳性32份，结肠弯曲菌阳性1份，阳性率分别为14.29%、0.45%。不同来源的样本弯曲菌感染率差异显著。散养鸡样品空肠弯曲菌阳性率为6.25%，规模化圈养条件下的鸡群样品空肠、结肠弯曲菌阳性率分别为14.56%、0.97%，分离自农贸市场的鸡源样品空肠弯曲菌阳性率达22.81%(表4)。不同时期鸡源样品的监测结果，污染率最高的是6—8月，达21.98%(表5)。

表4 不同采样点鸡源样品弯曲菌监测结果

表5 不同时期鸡源样品弯曲菌监测结果

2.3 食源样本弯曲菌的监测结果

共采集市场食物、污水及超市冷冻鸡肉346份，弯曲菌阳性率4.91%，监测结果见表6，共检测到13份空肠弯曲菌阳性，阳性率3.76%，其中污染率最高的为市场鲜鸡肉样品，达到10.98%，猪肉和蔬菜样品未检测到阳性。346份食源样品检出结肠弯曲菌阳性4份，阳性率1.16%，冷冻鸡肉未检测到阳性。

表6 食源样品弯曲菌监测结果

3 讨论

弯曲菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌，在自然界分布广泛，寄生在多种动物如禽类、牛羊、宠物犬体内[2]。该菌已经成为最重要的腹泻病原菌之一，尤其引起婴幼儿腹泻[3]。来源于医院腹泻患者的人源样本共采集了183份，弯曲菌阳性样品11份，阳性率6.01%，其中空肠弯曲菌阳性10份，阳性率5.46%，结肠弯曲菌阳性1份，阳性率0.55%。人源样本中有147份为5岁及以下婴幼儿患者样品，弯曲菌的感染率最高，达到6.80%，其中空肠、结肠弯曲菌的阳性率分别为6.12%、0.68%，而6岁及以上患者的36份样品感染率仅为2.78%，空肠、结肠弯曲菌的阳性率分别为2.78%和0.00%，这就提示了5岁及以下儿童是弯曲菌的主要感染者或者是带菌者，5岁及以下儿童可能是弯曲菌的宿主，在弯曲菌病流行过程中充当传染源的角色。不同时期人源样本弯曲菌的监测结果提示，夏季(6—8月)、秋季(9—11月)弯曲菌的感染率显著高于其他时期，达到高峰。不同来源的人源样本统计结果显示，医院门诊部的感染率显著高于住院部的感染率，这可能是因为门诊部病例尚未使用抗生素治疗，住院部病例在收集样品前已经使用相关抗生素。

分子流行病学研究表明，人类弯曲菌主要来源于家禽，尤其是鸡群。不同时期鸡源样品弯曲菌监测结果显示出了季节性，夏季是高峰期，季节性模式表明气候因素对动物群体中弯曲菌的流行起着直接或间接的作用。温度在13～20 ℃时鸡群中弯曲菌感染率迅速增加，随着温度的进一步升高，感染率会在较高水平上有较小的增加，因此春季后鸡群中弯曲菌的感染率增加显著，本试验的监测结果也提示鸡群中夏季弯曲菌的阳性率显著高于秋季。此外，世界范围内弯曲菌病的发病率同样具有很强的季节性，尤其是北欧国家。

食品禽肉中的弯曲菌主要来源于鸡群，减少养殖环节弯曲菌的感染率是控制禽肉产品中弯曲菌的重要前提，鸡群中弯曲菌的来源及影响菌体定殖的因素主要包括其他动物(家畜、苍蝇、宠物等)、饲养人员、环境、设备、饮用水等。牛被认为是鸡群弯曲菌的可能来源。弯曲菌在牛和肉鸡之间存在间歇性的双向传播[4]。苍蝇可能是鸡群中弯曲菌引入的载体，感染有弯曲菌的苍蝇在夏季通过通风进入鸡舍，有研究证明在鸡舍通风入口处使用灭蝇设备可以避免夏季弯曲菌感染率高峰期的出现[5]。饲养人员及设备被认为是引起鸡群弯曲菌传播的危险因素，饲养员在工作过程中应该遵守生物安全程序，如洗手洗澡、不同鸡舍不交叉使用靴子、浸泡鞋子、更换鞋子和外衣、鸡舍保持整体的清洁等。此外，运输包装箱也需要定期浸泡消毒液彻底消毒。鸡肠道内弯曲菌的大量存在会造成屠宰过程中的交叉污染，给食品安全造成巨大隐患，有必要在屠宰加工前对鸡群进行检测，阳性鸡群和阴性鸡群分开屠宰。

屠宰加工过程中，粪便清除、脱毛、内脏取出等环节可能导致粪粒对于食品的污染，这些环节是食品安全的关键控制点。有研究指出，使用特殊的真空装置可减少内脏去除环节肠内容物泄露造成的交叉污染[6]。冷空气预冷代替浸泡和旋转预冷可以避免预冷产生的交叉污染。弯曲菌对温度、氧气、渗透压等较为敏感，采取适当的杀菌措施可有效降低禽肉表面弯曲菌的污染水平，如在屠宰加工过程中使用消毒剂处理禽肉胴体，用消毒剂消毒冷藏车、屠宰洗涤池等，此外冷冻处理法也是一种实用且有效的方法，弯曲菌对低温较为敏感，低于30 ℃便不再生长，低温储存、运输是降低肉品表面弯曲菌数量的有效措施。

本试验采集的346份食源样本，空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的阳性率分别为3.76%、1.16%。空肠弯曲菌对食品和环境的污染高于结肠弯曲菌，说明食品和环境中弯曲菌的污染以空肠弯曲菌为主。超市冷冻鸡肉弯曲菌2.38%的污染率低于市场鸡肉12.20%的污染率，主要是由于弯曲菌在冷冻条件下生存能力急剧下降。市场生鸡肉样品中空肠弯曲菌的污染率显著高于其他样品，进一步提示鸡肉是引起人类弯曲菌感染最主要的食源性传染源，因此加强禽类及禽肉产品的食品安全管理是控制弯曲菌感染的重要环节。市场蔬菜和污水中弯曲菌的污染往往由动物性食品或动物粪便引起。猪肉样品中结肠弯曲菌污染率高于空肠弯曲菌，提示猪肉产品中的污染以结肠弯曲菌为主的可能，当然这还需要更大样本的数据支撑。

鉴于食品尤其是肉制品中弯曲菌的污染情况，在肉品消费阶段可以采取一些措施控制污染，如生肉、熟肉分开存放，切割生肉时使用单独的砧板等。另外，对食物进行热处理也是一个最常用的避免污染的方法。烹饪食品时，食品内部温度达到70 ℃并维持2 min以上，或内部温度达到65 ℃维持10 min以上可以杀死包括弯曲菌在内的绝大多数病原菌。食物高压处理、气溶胶食品包装技术也都能达到消毒的目的。