孔雀鱼胚后发育的器官组织学发生研究

方珍珍， 范 强， 陶秉春， 陈成勋

(天津农学院水产学院/天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

孔雀鱼(Poeciliareticulata)别称彩虹鱼、虹鳉、花鳉、百万鱼，英文名guppy，原产于南美洲和西印度群岛，孔雀鱼属鳉形目(Cyprinodontiformes)胎鳉科(Poeciliidae)[1]。因其游动起来美丽的花尾巴犹如孔雀开屏，故名孔雀鱼。目前国内外对该鱼的研究涉及多个领域，如繁殖生物学领域[2]、生化遗传学领域[3-5]等，对其胚胎学的研究有胚胎心血管发育等[6]，涉及其器官组织发生的有精子的发生等[7]，并对其滞后育雏[8]、体长分化[9]及胚心的体外培养[10]等进行了研究。本研究对即将产鱼及刚产后的孔雀鱼整体固定后，经常规石蜡组织切片技术制成组织切片，用生物显微镜对器官组织发生进行较系统的组织学观察。旨在通过对母体内幼鱼的器官、组织进行观察，获取相关资料，以期为孔雀鱼的器官组织发生研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2015年4月取自天津农学院水产养殖中心实验室Ⅲ养殖的孔雀鱼，当雌鱼肛门2侧的胎斑变大变黑时，即是临产征兆[11]，6尾试验用鱼平均体长为2.3 cm，平均体质量为 1.5 g。

1.2 方法

先后挑取6尾体质健壮、无伤无病的临产孔雀鱼停食 24 h 后用Bouin’s液固定，11 h后放入70%乙醇中备用。将保存在70%乙醇溶液中备用的临产孔雀鱼取出，再用70%乙醇溶液冲洗4～5次，洗去残色。叔丁醇逐级脱水，常规石蜡包埋切片，厚度5～6 μm，苏木精-伊红染色，中性树胶封片。采用Motic BA600-4数字切片扫描与应用系统高精度扫描切片并保存。之后用Motic数字切片助理Lite 1.0观察组织，采集图片。

2 结果与分析

2.1 消化系统

孔雀鱼的口腔在胚胎后期阶段已发育成型，产出后即能摄食，咽部有味蕾镶嵌于黏膜表面(图1-1，40×，TB表示味蕾)。胚胎后期阶段孔雀鱼的食道已经形成，其管腔开通。黏膜向腔面褶成皱襞，皱襞之间为固有膜，黏膜表面衬裱着复层鳞状上皮，在表层上皮之间有杯状细胞，可分泌黏液；黏膜下层仅由疏松结缔组织构成；肌层发达；浆膜为食道最外层，由薄层结缔组织组成(图1-2，20×，Mu表示肌层，LP表示固有膜，GC表示杯状细胞)。孔雀鱼在胚胎后期阶段肠道已形成并形成肠腔，黏膜未向肠腔突起形成皱襞，黏膜表面衬裱着单层柱状上皮，包含着吸收细胞和杯状细胞2种细胞。吸收细胞数量较多，呈高柱状，细胞核靠近细胞基部，细胞的游离面具有明显的纹状缘；杯状细胞不明显；固有膜及黏膜下层不明显，肌层较薄；浆膜由间皮及一薄层结缔组织构成，肠腔内有分泌物质(图1-3，10×，Se表示浆膜；图1-4，40×，CC表示柱状细胞，SB表示纹状缘)。孔雀鱼在胚胎后期阶段肝脏已形成，为一实质性的器官。肝脏的最外面被疏松结缔组织包裹，伸入肝实质内的结缔组织很少，肝小叶的间隔不明显；肝小叶中央有一血管为中央静脉；肝细胞形态不明显，仅见其细胞核呈圆球形，位于中央；肝血窦清晰，其形状不规则(图1-5，10×，HS表示肝血窦，CV表示中央静脉)。孔雀鱼的胰脏在胚胎后期阶段已经形成，分布复杂散乱，弥散于肠系膜上；胰腺腺泡上分泌物明显(图1-6，10×)。

2.2 呼吸系统

孔雀鱼的鳃在胚胎后期阶段已经形成。有4片鳃，鳃弓明显，由复层扁平上皮构成，内有软骨细胞，鳃弓下方有出鳃动脉和入鳃动脉2支血管平行排列，鳃弓和血管之间有结缔组织填充；鳃弓一侧为鳃耙，另一侧为鳃丝固着其上，鳃丝另一端游离；鳃丝上的鳃小片发育不完善(图1-7，10×，GA表示鳃弓，Gr表示鳃耙，→表示出鳃动脉，←表示入鳃动脉)。

孔雀鱼的伪鳃在胚胎后期阶段即已发育成型，毛细血管清晰；鳃片排列不如正常鳃片有序；鳃片中有许多小片，小片较密集；上皮细胞近于立方状，其细胞核颇大，圆形，位于细胞边缘(图1-8，×40，BL表示鳃小片，EC表示上皮细胞)。

2.3 排泄器官

孔雀鱼的头肾在胚胎后期阶段已经形成，结构简单，由肾主质和肾间质组成。肾主质由前肾小管和肾小球构成，前肾小管由单层上皮细胞组成，肾小球由肾小囊内的毛细血管盘曲而成；肾间质含有丰富的造血细胞，具有造血功能(图1-9，40×，RC表示肾小体，UT表示肾小管)。

孔雀鱼的中肾在胚胎后期阶段已经发育成型，已经具有排泄功能，由肾间质与肾实质组成。肾小管管壁为单层立方上皮，细胞游离端有刷状缘(图1-10，40×，UT表示肾小管)。肾小球发育完善，毛细血管壁较厚；肾小囊内包裹着血管球，囊壁分脏层和壁层，脏层与壁层之间有一狭窄的腔隙，为囊腔，外壁由单层扁平细胞构成，孔雀鱼在胚胎后期阶段已形成脾脏，发育不完善，其红髓和白髓清晰可见，但两者分界明显，各位于一侧，不为红白相间；脾脏表层为皮质，内部为髓质，由大量红血球及结缔组织构成。(图1-11，40×，RP表示红髓，WP表示白髓)。

2.4 内分泌器官

孔雀鱼的胸腺在胚胎阶段后期已经形成，皮质与髓质清晰易辨，红白髓相间；髓质里淋巴细胞染色较深(图1-12，40×，Co表示皮质，Me表示髓质)。

孔雀鱼的甲状腺在胚胎后期阶段已发育成型，为弥散性的，分布于腹主动脉和第Ⅰ至第Ⅲ鳃动脉周围的鳃区间隙组织里，由甲状腺腺泡组成，腺泡内为嗜酸性染色的胶体，腺细胞核为圆形(图1-13，40×，TG表示甲状腺)。

孔雀鱼的脑垂体在胚胎后期阶段已发育成型，其上神经部和腺垂体清晰可辨，与间脑相连，位于间脑的腹面(图1-14，5×，HY表示脑垂体，Di表示间脑；图1-15，40×，PN表示神经部，Ad表示腺垂体，Di表示间脑)。

2.5 感觉器官

在胚胎后期阶段，孔雀鱼的嗅囊已发育成型。基细胞清晰，固有膜由结缔组织构成，含有血管；支持细胞、杯状细胞及嗅细胞形态不明显，黏膜上皮的皱褶未形成。产出之后即具有感受食物所产生的化学刺激并寻找食物的作用(图1-16，40×，BC表示基细胞，Ca表示毛细血管)。

孔雀鱼在胚胎后期阶段，眼睛已基本发育成型。晶体清晰，其实质是由细长的晶状体纤维组成；视网膜清晰，在视网膜与晶体间的后房内存有大量的毛细血管；色素膜、脉络膜、银膜明显；巩膜内有软骨细胞分布；角膜由结缔组织构成，虹膜内含血管和色素细胞，分布于晶体的2侧(图1-17，8×，Le表示晶体，Re表示视网膜，Pi表示色素膜，Co表示角膜，Ir表示虹膜；图1-18，20×，Sc表示巩膜)。孔雀鱼的内耳在胚胎后期阶段已发育成型，可见听嵴、听斑、感觉毛(图1-19，20×，Ma表示听斑，←表示感觉毛)。

2.6 心脏

孔雀鱼的心脏在胚胎后期阶段已发育完善，其心耳、心室已分化成型，心耳的壁较薄，心室的壁较厚，能进行血液循环(图1-20，15×，At表示心耳，Ve表示心室)。

2.7 中枢神经系统

孔雀鱼的脑在胚胎后期阶段已分化成型，端脑、间脑、中脑、小脑及延脑发育完善(图1-21，4×，Me表示中脑，M表示延脑，SC表示脊髓，Te表示端脑)。胚胎后期阶段，孔雀鱼脊髓组织结构已发育完善，其灰质区、白质区清晰易辨(图1-22，30×，WA表示白质，GM表示灰质)孔雀鱼在胚胎后期阶段脊神经节已发育成型，位于脊髓旁(图1-22，30×，SG表示脊神经节，SC表示脊髓，No表示脊索)。孔雀鱼在胚胎后期阶段皮肤发育完善但不明显。头部的皮肤含2层较薄的上皮细胞，真皮内可见色素细胞，皮穴器官，仅有疏松层，未见胶原层(图1-23，40×，Mel表示色素细胞，CO表示皮穴器官，)；躯干部皮肤未见疏松层；尾部皮肤可见色素细胞，表皮细胞为2层扁平细胞(图1-24，40×，Mel表示色素细胞)。

3 结论与讨论

3.1 性成熟与繁殖周期

本研究孔雀鱼在养殖期所处水温维持在29 ℃左右，从试验孔雀鱼刚从母体中产出至处于临产状态，共计96 d。张宇认为，孔雀鱼属于卵胎生鱼类，直接产小鱼，性成熟早，幼鱼经3—4个月饲养便进入成熟期，可以繁殖后代，性成熟迟早与水温高低、饲养条件密切相关[1]。可见孔雀鱼的性成熟周期随着水温的变动而有所不同。与试验鱼所处相同环境下的其他孔雀鱼，其雌鱼达到性成熟后繁殖周期为21 d，这与观赏水产养殖学描述的繁殖周期30 d左右不相符[12]，可能与温度高低有关。楼允东认为，在适温范围内，提高水温可引起胚胎提前出膜；不适宜的温度能使胚胎的某些结构的发育特别加快或特别受到抑制而形成畸形发育[13]，本研究养殖孔雀鱼在水温为29 ℃左右时，产出的小鱼中出现个别脊椎骨弯曲的情形。以成熟的雌鱼为例，代谢速度过快，容易使鱼体内钙质加速流失，如果再加上产后失调，即有可能出现脊椎弯曲的情况，弯曲程度越大越容易压迫内脏，从而威胁孔雀鱼的生存。

3.2 消化系统

孔雀鱼胚胎后期食道已经形成且有皱襞，有黏液细胞和杯状细胞，细胞的分泌物能润滑食物，有利于食物的运输[14]。叶元土等认为，肠道对食物的消化和吸收主要与黏膜表面结构和肠道的分泌能力有关[15]。杯状细胞能分泌黏液和消化酶，一方面对上皮起润滑作用，另一方面与消化酶共同作用消化[14]。因此，杯状细胞的多少可间接反映鱼类的消化能力。孔雀鱼胚胎后期杯状细胞较少，肠腔内表面纹状缘清晰且腔内含有吸收物，胆囊内有胆汁分泌，可见孔雀鱼胚胎后期已经可以进行食物的摄取和消化。

硬骨鱼类肝脏的形态因种而异。多数硬骨鱼类肝脏分叶，少数鱼类肝脏仅由单叶构成；肉食性硬骨鱼类肝脏为实心腺体[16]，草食性或杂食性鱼类其肝脏分散在肠系膜上，且混有胰腺组织。孔雀鱼肝脏为实心腺体，体现了其杂食性鱼类的特点。肝脏主要分泌胆汁，帮助消化脂肪。胰脏为弥散型，有少量胰脏组织伸入到肝脏中，大部分胰腺弥散于肠系膜中，胰腺细胞中有丰富的酶原颗粒。肝胰脏结构特点说明孔雀鱼对食物分解代谢能力较强。

3.3 排泄器官

硬骨鱼类的肾脏一般分为头肾、中肾、后肾3个部分。硬骨鱼类的头肾是重要的免疫和造血器官，其功能类似哺乳动物的脊髓[17]，鱼类抗菌、抗炎的免疫调节机制与哺乳动物类似，其在对虹鳟头肾免疫机制研究中已得到验证[18]。鱼类头肾在胚胎时期起源于前肾，具有泌尿功能，成体后因鱼类物种不同，其组织结构及生理功能也存在较大差异，弹涂鱼(Periophthalmuskoelreuteri)等鱼类的头肾中分布有许多与后肾一致的功能性肾单位结构[19]。本研究也发现孔雀鱼头肾与中肾一致，都具有功能性肾单位结构。孔雀鱼的头肾也是机体重要的造血和免疫器官，且具有泌尿功能。

3.4 心脏

心脏的静脉窦及动脉球均未发现，由于心耳、心室已发育完善，其静脉窦及动脉球也已发育成型，可能为制片问题导致，试验操作有待进一步改进。

3.5 眼睛

孔雀鱼在胚胎发育早期，晶体与视网膜之间存在丰富的毛细血管，目前尚不清楚毛细血管的作用，有待进一步研究。

试验孔雀鱼在胚胎阶段各个器官都已基本发育成型，仔鱼产出后即能进行平游，且可以摄食。随着仔鱼的发育，其各器官组织形态与胚胎阶段是否存在差异目前尚未有文献报道，有待于进一步研究。