活体取样并鉴定荷花花芽分化时期的方法研究

胡 鑫， 王彦杰， 金奇江， 杨平仿， 徐迎春

(1.南京农业大学园艺学院，江苏南京 210095； 2.中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室，湖北武汉 430074)

荷花(Nelumbonucifera)为睡莲科(Nymphaeaceae)莲属(Nelumbo)多年生水生草本植物，是我国十大传统名花之一，栽培历史悠久，有着深厚的文化底蕴；其花高雅脱俗，具有很高的观赏价值，其藕(根状茎)、莲子、叶可食用或药用，具有很大的经济价值，是我国目前种植面积最大，品种资源最丰富的水生观赏经济植物[1]。

荷花开花及花发育的分子机理是目前的研究热点，通常需要采集处于分化状态的花芽鲜样作为研究材料，但由于以下几个原因导致荷花花芽鲜样的采集工作十分困难：(1)荷花花芽的分化时间很短，自花芽开始孕育到分化结束只有 3～5 d[2]。有学者观察到，当花柄形成且开始伸长的时候(此时花柄还未出土，更未出水)，花芽分化已经进入了雄蕊分化期。所以当人们肉眼看到花柄出水、露出花蕾时，此时花芽的分化早已完成，已经处于花芽的发育阶段，此时取样已无法开展针对分化阶段花芽的相关研究，大大限制了荷花花发育的分子机制研究工作的顺利开展。(2)由于荷花的花芽发生于地下的根状茎上，要想准确取到处于分化状态的花芽必须将根状茎挖出，操作十分不便。且由于荷花花芽的芽体很小，似米粒大小，靠肉眼剥芽观察很难判断出花芽分化处于哪个阶段。(3)虽然采用石蜡切片法及电镜扫描法能够准确鉴别花芽分化的时期[3]，但这2种方法耗时较长，且都要杀死并破坏花芽(纵切或横切)，无法满足花芽活体取样的要求，导致对花芽本身的研究无法进行[4-6]。

目前的研究中仅有将花芽、顶芽、相连的莲藕及莲叶进行采样，其中花芽和顶芽采用石蜡切片法鉴定花芽分化时期，再将对应不同花芽分化时期的莲藕及莲叶进行相关生理指标的测定[7]，对花芽本身并没有深入的研究。而借助体视显微镜进行活体剥芽观察，不仅不会破坏花芽的芽体，可迅速观察辨别花芽分化的时期，还可进行花芽样品鲜样的保存。很多植物借助体视显微镜观察可快速鉴别所取的花芽所处的分化时期，对花芽本身进行相应地研究，如苦瓜花芽分化的解剖学观察及花粉活力的研究[8]。而在荷花上尚未见到相关报道。

因此，本研究以盆栽荷花品种为试验材料，采集根状茎上的花芽，并在体视显微镜下剥芽观察其解剖结构特征，鉴别其所处的花芽分化阶段，确定花芽分化时的花芽发育状态，为准确地进行处于分化期的花芽的取样提供技术手段，为后续以花芽为试验材料的相关研究提供了材料保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以江苏南京艺莲苑水生花卉公司提供的重瓣型荷花品种春雨(图1)为试验材料。于2015年5月上旬，将供试品种的种藕种植于460 mm×310 mm的塑料花盆中，土层厚约 20 cm，水层3～5 cm，共250盆，每盆1株，正常肥水管理。

试验材料共250盆，正常开花230盆，所需各个状态花芽分别取样约200个，体视显微镜观察200个。

1.2 花芽取样方法和解剖学观察方法

通过观察发现，供试荷花品种在第4张立叶出现之后即可肉眼观察到出水的花枝(花柄出水，花蕾清晰可见)，因此对花芽的取样均在第4张立叶开过1朵花之后进行。采样时间在2015年6—8月之间。

选取已开花的盆栽荷花植株上，首先根据叶片的幼嫩程度确定最新长出的立叶，然后用手从该立叶的叶柄基部深入到泥中向下挖，直到触碰到立叶所着生的藕节，将其挖出，一般紧邻该立叶着生1个花枝，有的已出泥但未出水，有的可能已出水；自花枝向立叶的生长方向即为藕鞭生长的方向；顺着该方向，继续沿藕鞭向前挖，依次可以看到未出泥的叶芽及花芽、最新生成的顶芽，该花芽以及顶芽内的花芽即为仍处于分化状态的花芽。

分别采集以下3种不同发育状态的花芽：(1)顶芽中的花芽：主要是种藕的顶芽，包括子藕开花后的顶芽；(2)未出泥的花芽：此时叶芽已冲出芽鳞，花芽紧靠于叶柄背后，具有长柄；(3)刚出泥的花芽：此时立叶已经形成，花芽已冲出芽鳞。

芽子采后立即在体视显微镜下用解剖刀进行剥芽解剖，以观察判别花芽分化的进程。

剥芽的方法：用镊子将芽的外鳞轻轻剥掉，不要伤及芽体；当出现内层结构时，在体视显微镜下用解剖针小心地去除内层小鳞片，使其生长点露出，参照文献报道的荷花花芽分化各阶段的形态特征进行供试材料所处分化阶段的鉴别，并拍照[9-10]。

2 结果与分析

2.1 荷花花芽着生的部位及发生的顺序

根据对荷花植株生长的田间观察及翻盆观察，发现最新的立叶基部旁总伴生花芽，顶芽中也包含花芽。从图2中可看出，沿着种藕的生长方向，花芽着生于叶芽后面，因此，可以通过叶芽花芽所处位置辨别生长方向，进而发现尚在泥中的最新立叶及伴生花芽。

2.2 荷花顶芽的基本结构

从图3可知，1个完整的顶芽，具有第1复合芽及可观察的第2复合芽。将复合芽进行进一步的解剖观察。

从图4可以看出，花芽的第1复合芽中花芽已经成形，花柄伸长；第2复合芽中虽然叶片以及花芽虽很小，但是也可以清晰地看到花柄伸长。

笔者猜测，分化初始期、萼片分化期、花瓣分化期均在顶芽的第2复合芽中完成，整个花芽分化过程均在泥中进行，当花芽出泥后均已接近分化结束。因此，在肉眼可以判断花芽并可采到花芽的情况下，基本没有观察到雄蕊分化前的分化情况。

2.3 荷花3种发育状态花芽的形态特征

观察发现，供试品种3种发育状态的花芽的形态特征如下(图5)：(1)顶芽中的花芽。此时花芽与叶芽一起仍被芽鳞片包裹在顶芽中，具有花柄，淡黄色，无刺，花萼顶端带有红色。(2)未出泥的花芽。此时叶芽已冲出芽鳞，花芽紧靠于叶柄背后，花柄伸长，淡黄色，无刺，芽体变大。(3)刚出泥的花芽。此时立叶已经形成，花芽已冲出芽鳞，花柄上带刺，但未见阳光，仍呈现淡黄色，花萼颜色变深。(4)与此对比的是已经分化结束的已出水的花芽，花芽独立生长，花柄带刺，绿色，花萼颜色更深且带有绿色。

在剥芽法下，根据采样的类别不同，利用体视显微镜可以分辨出来的是雄蕊分化期、雌蕊分化期、花托向上发育期：(1)顶芽中的花芽基本处于雄蕊分化阶段，可观察到花瓣原基的细胞进一步分裂并继续伸长的同时，其内侧基部表皮下细胞分裂又形成新的突起，成为雄蕊原基(图6-1、6-2)。(2)未出泥的花芽基本处于雌蕊分化阶段，可观察到雄蕊原基内侧、花原基顶部中央表皮下的细胞发生分裂，花托的顶部逐渐分化出若干个小丘状突起，即为心皮原基，随后转变成为短柱状突起(图6-3、6-4)。(3)刚出泥的花芽由于雌蕊原基的细胞分裂速度不同，可观察到雌蕊原基形成了外侧高、内侧低的浅杯状，然后转变成为桶状，顶端逐渐汇合，而后保留1个小孔，当心皮生长到一定的高度时，花托内所保留的分生组织开始分裂，使得花托体积不断扩大并向上生长，逐渐包围于心皮之外，构成了海绵状的花托，心皮各自埋藏于花托组织中(图6-5、6-6)。至此花芽分化结束。

2.4 荷花花芽分化初始期的推测

经过整个生长季的持续观察发现，供试荷花品种的所有复合芽，都具有能够分化出叶芽及花芽的能力。根据田间对荷花开花现象的观察，可以推测出相关规律，对今后的荷花花芽分化具体研究奠定基础。

从供试的荷花品种的花芽出现的规律来看，在环境适宜的情况下，花芽分化初始时期相同，即它在第4张立叶下开始形成花芽，在根状茎的分枝(子藕)上表现相似，也必须发育到第4张立叶才会出现花芽。

3 讨论与结论

本研究采取直接挖取花芽，进行体视显微镜活体解剖观察，从而鉴定所处花芽分化时期，并通过大量的解剖观察，将花芽分化时期与荷花花芽发育状态相对应，因此不用进行解剖和显微观察就可以直接确定花芽分化时期并进行芽体的鲜样保存，这与石蜡切片法和扫描电镜法相比更加简便、快捷，且可以获得完整的花芽鲜样。一般进行花芽取样观察时，多是进行翻盆取藕，这对处于生长旺盛期的植株是破坏性的，并且也需要一定的体力操作；而本试验对植株生长进行观察便可判断出种藕生长方向，并确定花芽的位置，直接取样，不需将整株取出，不会破坏植株其他侧芽的生长，也可进行2次采样。

本研究在取样的过程中，由于种藕存在差异，营养储存的程度不同，导致花芽形成时的大小不同，花芽花蕾的长度大小与其所处的分化阶段、发育阶段没有直接的关系。另外，由于栽种时种藕所处的土层有差异，生长发育情况不一致，花芽出水或出土时所处的土层厚度与其所处的生长阶段没有直接的关系。因此，花芽长度、花蕾大小、出土的土层厚度等指标并未进行定量测定。

从研究结果来看，重瓣型荷花品种的解剖结构与前人的研究结果[4]相同。通过石蜡切片法观察知道重瓣品种的花芽分化主要有分化起始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期、花托向上发育期；采用剥芽法，更加直观迅速地鉴定荷花花芽分化的过程，并简化了花芽分化时期的判断方法，在顶芽中尚未冲出芽鳞片的花芽处于雄蕊分化阶段；在已冲出芽鳞且未出泥的叶芽旁的花芽处于雌蕊分化阶段；已经出泥的花芽处于雌蕊分化后期以及花托向上生长发育阶段。虽然无法判断出全部6个分化时期，但了解这个过程，仍有助于进行花芽分化时的采样工作，对花芽本身进行进一步的研究具有重要意义。

以此类推，笔者在其他瓣型品种也用同样的方法进行试验，发现普遍具有这样的规律，但也存在个别特殊例子，比如宜良千瓣，在生长初期很少出现花芽，推测宜良千瓣需要大量的营养来供给开花，因而到后期才会大量形成花芽，本研究的取样方法只能在开花后起效。另也观测到未形成立叶便已有花芽的品种，先成花不长叶，后长叶少成花，这种特例不符合常规规律，因而无法准确地取得花芽。综上所述，对于一般荷花盆栽品种，该方法均可适用。