单核细胞趋化蛋白-1在抗中性粒细胞胞浆抗体相关系统性小血管炎中的研究进展*

兰秀君 综述 吴道全 曾光 杨舸 审校(.西南医科大学, 四川 泸州 646000;.内江市第二人民医院肾内科, 四川 内江 6400；.内江市第二人民医院检验科, 四川 内江 6400)

趋化因子(chemotactic)是一类小分子细胞因子家族蛋白。其共同结构特征包括: ①分子量小(约8～10 千道尔顿)。②有四个位置保守的半胱氨酸残基以确保其三级结构。③大多趋化因子和受体均可以与多个对应物相结合并产生趋化作用。④主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入感染部位, 参与炎性疾病的发生、发展。⑤在所有脊椎动物和一些病毒以及一些细菌中有趋化因子的存在, 但在其他无脊椎动物中尚未发现。根据其N 端保守半胱氨酸残基数目、排列方式与位置的不同, 可分为4 个亚族: CC、C、CXC 和CX3C。趋化因子和受体结合后, 激活和趋化白细胞, 吸引白细胞到感染部位, 参与炎症反应[1]。

1 MCP-1与CCR2

1.1 MCP-1的结构和分布 单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoatracttant protein-1, MCP-1), 即CCL2(CC chemotactic ligand 2), 也称为小诱导细胞(small inducible cytokine A2), 属于CC 亚家族, 亦称β 亚家族, 为一种可溶性碱性蛋白质。有13×103 和15 ×103两种分子质量, 按此又分为MCP-1α和MCP-1β 两种类型。其基因位于17 号染色体(17q11.2q12)。成熟的MCP-1有76个氨基酸: 3 个外显子和2 个内含子, 前面具有疏水性的23 个氨基酸残基, 组成一典型的信号肽顺序。天然状态的MCP-1 是被糖基化的, 实验证明, 重组的MCP-1 未被糖基化, 其活性与天然MCP-1 相同, 故MCP-1 糖基化并不是趋化活性所必需的。MCP-1可由多种细胞产生, 包括激活的单核/巨噬细胞、内皮细胞、纤维母细胞和平滑肌细胞, 另外星形细胞、骨细胞、表皮细胞和某些肿瘤细胞等也可产生MCP-1。正常肾组织中也有多种细胞譬如肾系膜细胞、肾小球内皮细胞、肾小管上皮细胞、成纤维细胞及浸润的免疫细胞受刺激后均可合成和分泌MCP-1[2-3]。

1.2 CCR2的结构和分布 MCP-1/CCL2的受体CCR2属于G蛋白偶联的受体超家族, 7个富含疏水氨基酸的α螺旋的跨膜片段相互由长短不一的肽链环接, 组成由梭基端在内、氨基端在外的蛇状迂曲的细胞表面受体。其基因位于3 号染色体(3p21), 开放阅读框架为1 065 个碱基对, 编码355 个氨基酸残基蛋白, 分子质量约41 ×103。CCR2基因的羧基末端由于不同剪切方式有差别, 就此分为CCR2A、CCR2B 两种类型, 后者多于前者, 后者在单核细胞和自然杀伤(NK)细胞中均有较高表达；前者则主要在部分单核细胞和平滑肌细胞中存在[2-3]。

MCP-1可以趋化和激活多种细胞, 包括单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞和B、T细胞, 但对中性粒细胞无趋化作用。而受体CCR2胞内区与G 蛋白偶联。G 蛋白的组成成分为α、β、γ 3 个亚单位, 形成紧密的二聚体。MCP-1与CCR2结合后, 将信号转入细胞内发挥多种生物学功能, 如MCP-1对记忆性CD4+T细胞有特异的趋化活性, 将T细胞与单核细胞、嗜碱性粒细胞募集至炎症部位, 并诱导细胞表达粘附分子(ICAM-1 )和释放IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子, MCP-1还可促进嗜碱粒细胞和肥大细胞释放组织胺趋化因子, 促进血管内皮细胞生成, 在炎症性疾病和新生血管形成及其损伤修复中发挥重要作用。文献报道[2-5], MCP-1/CCL2 参与了许多临床疾病的病理机制(如急性髓系白血病、肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、骨关节炎等)。

2 MCP-1/CCL2-1与肾脏疾病

2.1 MCP-1/CCL2与ANCA相关性小血管炎肾损害 ANCA相关性系统性小血管炎(AASV)是可累及全身各系统的自身免疫性疾病, 肾脏最常受累, 累及肾脏的部分称为“ANCA相关性肾炎(ANCA-associated glomerulonephritis, ANCA-GN)”, 肾脏病理呈寡免疫复合物节段性坏死性血管炎表现, 根据病程不同可以有肾病综合征、急性肾炎、急进性肾小球肾炎、慢性肾炎等各种表现。2012年Chapel Hill会议将其分为三类: 包括肉芽肿性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis, GPA)、显微镜下多血管炎(microscopicpolyangiitis, MPA)和嗜酸细胞性肉芽肿性多血管炎(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis, EGPA, 之前被称为Churg—Strauss综合征)[6]，目前有关AASV的发病机制尚未完全明确, 近年来国内外的相关研究显示其发病机制如下: ①环境及遗传因素。 ②ANCA的致病作用。 ③抗内皮细胞抗体(anti-endothelial cell antibodies, AECA)的致病作用。 ④补体旁路途径。⑤细胞因子作用。⑥T淋巴细胞B淋巴细胞作用。⑦感染和Toll样受体[7]。患者病情进展迅速, 预后凶险。国外有研究[8]表明, 20%～40%的AAV患者发展成为终末期肾病(end—stage renal disease, ESRD)。即使采用及时、有效的免疫抑制治疗, 5年内患者死亡率仍高达35%以上, 严重威胁人类健康[9]。目前，临床肾活检是诊断ANCA相关性小血管炎肾损害的金标准, 是评价预后较好的手段, 但因其具有创伤性及条件限制使其发展受到限制。由于这个原因, 致力于寻找非侵入性生物标志物用于预测治疗反应和疾病复发是有必要的。

MCP-1与CCR2和CCR4结合后, 可以通过蛋白激酶C(PKC)、p38丝裂原活化的蛋白激酶(p38 MAPK)和核因子κB(NF-κB)等途径, 趋化与激活单核/巨噬细胞到病灶部位, 促进炎性细胞因子表达及溶酶体释放和超氧离子生成, 加速肾脏损害[10]。就ANCA相关性肾炎, 传统的疾病标记有红细胞沉降率(ESR)、c反应蛋白(CRP)、血尿素氮、血清肌酐和蛋白尿, 血C3a, C5a、IL-18 ANCA, 伯明翰血管炎活动性分数(BVAS), 以及尿IgM和尿IL-8等[11-12]。由于其非特异性或某些局限性, 新近又开展了对溶酶体相关膜蛋白-2(LAMP-2)自身抗体、膜突蛋白(Moesin)抗体等及血DcR3, 尿高迁移率族蛋白(HMGB1)、尿CD163等新生物标记物的研究[13-14]。而在尿生物标记物中U-MCP-1是近几年趋化因子领域的研究热点, 也是肾脏病领域的宠儿, 在IgA肾病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等都有研究, 且都得到阳性结果[15-17]。

近年来就MCP-1/CCL2在ANCA-GN的研究也有上升趋势。目前ANCA作为AASV特异性血清学诊断指标, 我国常采用IIF检测联合总抗原ELISA检测, 阳性诊断特异性达80%以上, 敏感性为90%以上。可用于监测病情活动与复发。但并不能作为绝对的指导治疗决策, 且ANCA的滴度与肾脏损害程度无相关性[18]。ANCA通过“ANCA-FcrR-细胞因子序列理论”参与ANCA相关性肾炎的发病机制已被大多数人认可。Casselman BL[19]等通过体外实验发现, P-ANCA和C-ANCA免疫球蛋白可以触发孤立的人类外周血单核细胞(PBMCs)分泌MCP-1。

肉芽肿性多血管炎(GPA) 以往称为韦格纳肉芽肿, 是一种以系统性血管炎和肉芽肿形成为特点的自身免疫性疾病, 早期炎症细胞为中性粒细胞, 后期为单核细胞。蛋白酶3(PR3)是GPA ANCA的主要自身抗原, 在内皮细胞激活过程中扮演重要角色。aekema-Roelvink ME[20]等表明, PR3可增强MCP-1mRNA表达, 从而提供中性粒细胞和单核细胞的趋化和激活刺激。此外, PR3可直接增强中性粒细胞的粘附, 还可通过增强内皮细胞细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达, 进而加强中性粒细胞的粘附力, 从而放大了持续的炎症级联反应。Del Papa N[21]研究发现GPA激活的血管内皮细胞能促进白细胞募集和粘附在内皮表面, 调控e-选择素、细胞间粘附因子1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1), 进而诱导MCP-1分泌。Tomasson G[22]研究认为在AASV中, 相比于被广泛接受的急性期反应物CRP和il-6分别由肝脏和激活组织巨噬细胞产生, MCP-1可由发生炎症和损伤内的内皮细胞产生。他们发现在GPA患者中血清MCP-1升高, 但易受血小板浓度影响, 尿MCP-1水平升高与肾血管炎活跃性有关。Tognarelli S[23]研究表明在GPA, 肾微血管内皮细胞(MEC)在炎症刺激下可募集和激活NK细胞浸润血管壁, 参与肾脏血管的坏死。肾MEC比肺和皮肤MEC更容易受炎症信号的影响, 从而上调 ICAM-1和VCAM-1, 以及释放MCP-1。因此, MCP-1参与GPA的肾脏损害, uMCP-1可作为ANCA相关性肾炎早期活动性指标, 且较传统炎性因子更直接。Domingues VM[24]等发现, PR3-ANCA患者平均CRP值在正常范围内显著高于MPO-ANCA患者, 显示PR3-ANCA患者有更大的炎症活动。

显微镜下多血管炎(microscopicpolyangiitis, MPA) 是一种主要累及小血管(如毛细血管、小静脉或小动脉)的无免疫复合物沉积的坏死性血管炎。髓过氧化物酶(MPO)是MPA ANCA的主要的自身抗原。van der Veen BS[25]等通过建立抗MPO型ANCA相关性坏死性新月体肾炎(NCGN)模型发现MCP-1和CCR2的表达水平增加, 尤其是在肾小球。Nagao T[26]等通过SCG/Kj老鼠建立的MPA的模型, 发现MCP-1可以趋化巨噬细胞和T 细胞浸润, 从而参与新月体形成。Lloyd CM等[27]表明在新月体肾小球肾炎小鼠模型中MCP-1趋化单核/吞噬细胞进而使肾小球硬化和Ⅰ型胶原沉积发挥核心作用。

嗜酸细胞性肉芽肿性多血管炎(EGPA), 是以过敏性哮喘、嗜酸性粒细胞增多、发热和全身性肉芽肿血管炎为特征的疾病。MPO是MPA ANCA的主要的自身抗原。Kerstein A[28]等认为, 相比于GPA和MPA中, 效应T细胞以CD4+CD28-T 辅助1型(Th1)和Th17细胞为主, 在EGPA中, Th2型和Th17细胞更多见。在EGPA中, 嗜酸性粒细胞、Th2型细胞和嗜碱性粒细胞浸润, 增加包括MCP-1在内的趋化因子表达。目前就EGPA的相关体外实验很少。

一些生物标记物与AASV疾病活动相关联, 如血标志物CRP、C3a、C5a 和尿标志物尿MCP-1(uMCP-1) 、uCa5。uMCP-1、ESR、CRP等炎性指标, 尿蛋白定量、尿素氮、尿白蛋白、肌酐清除率等肾功能指标均呈正相关, 而且随着药物治疗、临床症状的缓解而逐渐降低[29]。Tam FW等[14, 30]发现uMCP-1水平与BVAS成正相关, 故uMCP-1可作为ANCA相关性肾炎的活动性指标。Ohlsson S[31]和Lieberthal JG[32]等发现, 血浆中MCP-1与CRP、ANCA、BVAS、U-IL6 和U-IgM没有相关性。与其他形式的肾小球肾炎相比, uMCP-1在ANCA相关性血管炎中的特异性为94%, 敏感性为89%, MCP-1水平升高与其不良预后和复发有关。Csernok E[33]Kanzaki G[34]等发现转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等前炎症因子在三种ANCA相关性血管炎中均过度表达。而以上前炎症因子可诱导MCP-1表达, 进而加剧新月体形成、肾小球纤维化及瘢痕形成。同样许多研究[35]表明, 当肾组织受到炎症等刺激后其MCP-1 的mRNA 及蛋白质表达明显增加, 趋化并激活单核/巨噬细胞, 除此之外, 通过活化NF-κB 和活化蛋白-1 途径等促进肾小管上皮细胞多种细胞因子如IL-6、ICAM-1 和TNF-α的分泌、促进溶酶体释放和超氧离子的生成, 进而促进肾小球硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化。未来的研究在不同的患者人群中测量相关的生物标记物可能会促进对血管炎的病理生理学和疾病活动的理解。如果选择几个识别不同疾病活动领域的生物标志物进行复合测量可以更精确地用于指导治疗。目前Kronbichler A[29]就GPA和MPA通过联合uMCP-1与CRP用于GPA和MPA的活动性及预测疾病复发其敏感性及特异性为76%。

综上所述, MCP-1通过趋化并激活单核/巨噬细胞, 促进多种炎性介质参与ANCA相关性肾炎的发病过程。uMCP-1相较于ESR、CRP、ANCA、BVAS, 以及标记U-IgM和U-IL-8等, 有前景作为ANCA相关性血管炎活动性、肾损害程度指标, 并用于评估治疗效果、预后及复发倾向。

2.2 MCP-1/CCL2与其他肾脏疾病 糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病未受控制的一种常见微血管并发症。大量研究表明, DN患者的MCP-1的mRNA和蛋白表达均有上升, 进而参与DN炎症反应。在高糖、高脂环境下, 肾小管上皮细胞胞质中高表达MCP-1, 进而趋化和激活单核/巨噬细胞, 因此有大量的巨噬细胞在皮质小管外周聚集, 以引起肾小管损伤以及肌成纤维细胞的聚集, 从而导致DN患者的肾脏的炎症及纤维化的出现。大量研究[36]表明, uMCP-1与糖化血红蛋白、肾间质CD+68巨噬细胞、尿N-乙酰-p-D-葡萄糖苷酶(NAG)、尿微量白蛋白(UALB)、血尿素氮、血肌酐呈正相关, 与疾病的严重程度成正相关, 可作为早期诊断2-DN的有效指标。更有研究[37]发现合并骨质疏松患者MCP-1表达高于无骨质疏松患者, 且MCP-1表达水平与骨密度呈负相关。表明MCP-1可诱导阳性端粒酶, 诱导单核细胞产生破骨细胞, 进而参与骨质疏松症的形成。

狼疮性肾炎(lupus nephritis, LN)是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)的肾脏损害。一半以上患者有肾损害表现, 金标准肾活检检出率为100%。血清及尿液MCP-1表达水平与狼疮性肾炎活动性及病理类型有一定的关联, 尿液中MCP-1水平与血肌酐浓度、白蛋白尿、肾间质CD68 +、SLE疾病活动指数(SLEDAI)呈正相关。多项研究[38-39]一致认为MCP-1参与LN的发病机制, 并且与疾病的进展有关, 临床上, LN患者MCP-1可用于病情严重程度、疗效好坏、预后判定及病理分型。

过敏性紫癜(Henoch-Schnlein purpura, HSP)是以免疫因素介导IgA沉积于血管壁, 以小血管特征性炎性改变为主的一种系统性全身性疾病。累及肾脏者称为紫癜性肾炎(Henoch-Sch nleinpurpuritic nephritis, HSPN)。国内外学者研究[40-42]表明, 血浆MCP-1水平可用于评估HSPN 患儿肾脏受损的程度和疾病的进展。uMCP-1在HSPN患儿尿液中明显升高, 且随尿蛋白含量的增加而增加, 并且尿液MCP-1 与尿TGF-β1水平、尿白蛋白排泄率、β2 微球蛋白呈正相关, 表明uMCP-1 水平与疾病活动及肾损伤相关, 有助于提前对HSPN病情的活动性及轻重作出判断。

3 小结与展望

MCP-1/CCL2是近几年趋化因子领域的研究热点, 大量研究表明MCP-1/CCL2是参与肾损伤的重要趋化因子, 且uMCP-1在不同肾脏疾病中高表达。ANCA相关性小血管炎随着ANCA检测的成熟在临床上越来越常见, 但常误诊延误病情。肾活检虽被认为是诊断的金标准, 但因其具有较大的风险和创伤, 患者及其家属均不易接受, 且病理检测要求较高的条件, 很难普及开展。血、尿液标本易于收集, 完全无创, 患方易接受, 血、尿中的生物标志物可以为临床诊治、疾病监测提供依据。目前, 就ANCA相关性肾炎, 缺乏早期、特异性的生物标记物。而在ANCA相关性血管炎中, 肾损害组尿MCP-1水平明显高于那些没有肾脏参与者, uMCP-1已被证明是最好的尿标记物, 但相关研究太少, 国内尤甚。因此, 努力寻找uMCP-1与ANCA相关性肾炎相关指标的关系, 研究uMCP-1水平与肾脏严重程度、疗效好坏、预后判定中有无规律, 以期减少或取代肾穿刺, 并为研究MCP-1中和抗体药物提供理论依据, 为患者带来福音。

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