DNA甲基化在胰腺癌检测及治疗中的应用

王宇新 陈 晶

【提要】胰腺癌是二十一世纪人类面临的高度恶性肿瘤之一，在我国占癌症死亡原因的前10位。大多数患者在确诊时已发生转移，失去根治性手术时机，预后差，在近年来，影像学技术的发展提高了胰腺癌的检出率，但是对胰腺癌特别是微小胰腺癌诊断的特异性尚不尽人意。胰液的细胞学诊断曾被用于胰腺癌的诊断，但在细胞形态学上区分肿瘤细胞或炎症细胞亦比较困难，其准确性较低。胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难，缺乏有效治疗手段。因此，迫切需要深入探讨胰腺癌发生、发展的分子机制，以寻找早期诊断和治疗胰腺癌的新途径。DNA甲基化在胰腺癌发生、发展过程中作用重要，进行胰腺癌DNA高甲基化基因的检测将指导胰腺癌的诊断及靶向治疗。

胰腺癌是最致命的癌症之一，5年生存率不到10%。虽然胰腺癌只占所有癌症病例的2%～3%，但它是世界第四大癌症死亡的主要原因。在胰腺癌中，只有10%～20%的患者会接受治疗，尽管做了手术，很多病人还是会复发。只有一小部分肿瘤切除的患者，5年生存率高达54%。不接受手术的病人的平均存活时间为确诊后3到6个月[1]。胰腺癌的高死亡率主要是由于该病的恶性进展较为迅速和早期非特异性的症状，在疾病的早期患者可能没有症状，并且腹痛、体重减轻和黄疸等症状与慢性胰腺炎的症状非常相似；慢性胰腺炎是胰腺癌的已知危险因素之一，另一个预后不良的重要原因是药物抵抗，因此唯一的治疗方法是及早发现疾病，并完全切除肿瘤[2]。目前，还没有诊断胰腺癌的有效标记。碳水化合物抗原19-9（CA-19-9）水平在胰腺癌中会升高，但通常仅在癌症晚期，并且它在其他癌症、慢性胰腺炎和风湿性关节炎等自身免疫性疾病中也可以升高[3]。此外，复杂和先进的成像方式结合在一起，正电子发射断层扫描等三相计算机断层扫描、超声内镜、腹腔镜超声检查，内镜逆行胰胆管造影对胰腺癌的诊断也是必要的。这些方法中有一些是侵入性的，因此有可能出现并发症[4]。所以，迫切需要一个微创的或非侵入性的胰腺癌标记物。越来越多的证据显示胰腺癌发病与多基因病变有关，这包括DNA序列变化引起的基因突变和非DNA序列变化引起的基因表达变异，后者指在细胞分裂过程中基因修饰对遗传物质表达的影响，并可通过细胞增殖向下遗传，包括表现遗传修饰等，其中最常见的分子机制有DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和RNA干扰等。

一、DNA甲基化

DNA甲基化包括在鸟苷上添加一个甲基（CH3）残留物，被称为CpG二核苷。这种修饰是通过DNA甲基转移酶（DNMT）催化的。CpG二核苷位于CpG-丰富的区域被称为CpG岛。人类基因组中60%启动子区域的基因包含一个或更多的CpG岛，在正常情况下，只有5%的启动子序列被甲基化。在整个人类基因组中，大约50%到70%的核苷都被甲基化了，大多数甲基化的CpG二核都位于重复的基因组序列中[5]。有研究认为哺乳动物基因组只发生胞嘧啶甲基化[6]。CpG岛甲基化可引起甲基化结合蛋白和转录抑制物组蛋白乙酰化酶等结合到CpG岛，阻断转录因子结合到启动子上，从而抑制基因表达。因此DNA甲基化可提供研究及治疗肿瘤的新方向。人类许多恶性肿瘤在发生过程中都存在DNA甲基化紊乱，即胞嘧啶甲基化异常，主要可概括为癌基因低甲基化或抑癌基因高甲基化，导致癌基因表达或活性增加，抑癌基因沉默或表达下调。在多种肿瘤发展相关的异常凋亡、自噬过程中同样以相关基因的DNA甲基化修饰异常最为多见[7]。

二、DNA甲基化与胰腺癌的关系

异常的DNA甲基化（低甲基化和超甲基化）与癌症发生密切相关，但是单个癌基因甲基化的规律及基因被激活和沉默的时机还尚不清楚[8]。重复序列的DNA低甲基化可能是早期致癌的一个主要原因，当低甲基化发生在大部分基因时，会导致染色体不稳定；在启动子序列中，DNA的超甲基化通常发生在CpG岛，DNA超甲基化与DNA甲基转移酶的过度表达有关，肿瘤抑制基因的启动子区域的超甲基化导致肿瘤抑制功能的减弱或沉默。致癌基因启动子区域的低甲基化作用可能导致此基因表达增加[9]。

癌细胞将细胞内的DNA释放到血液中并可以在血浆和血清中检测到，这些DNA的异常甲基化可能是肿瘤所特有的，对胰腺癌的发展有潜在的帮助[10]。此外，异常的甲基化作用已经在胰腺的癌前病变中表现出来，这表明启动子甲基化参与了早期的癌变，随着结构异常的增加，甲基化程度也不断增加，并且已经证明，特定基因的异常甲基化可以作为判断胰腺肿瘤进展的指标[11]。

三、DNA甲基化与胰腺癌的诊断

在胰腺肿瘤形成过程中，基因甲基化异常有助于了解表观遗传学在肿瘤形成过程中所起的作用，并可作为肿瘤标志物。胰腺癌的早期诊断非常困难，具有诊断价值的生物标志物的检测非常必要。

1.DNA甲基化与胰腺癌诊断的标志物

BNC1是一种蛋白质，在人类中由BNC1基因编码，该基因位于15号染色体上。BNC1的信使RNA蛋白质主要局限于表皮的基底细胞的细胞核、外根鞘和毛囊的基质。这些区域被认为包含增殖细胞而缺乏特异的分化细胞。BNC1的表达是由P63引起的，它是一个具有不同亚型的转录因子，可同时作为致癌基因和肿瘤抑制基因[12-13]。BNC1蛋白质拥有3对锌指，可在人类核糖体RNA基因启动子上产生3个DNase（脱氧核糖酶）-1足迹（结合位点）。BNC1被认为通过调节Hedgehog信号通路作为RNA聚合酶1和RNA聚合酶2的转录因子。Shames[14]在2006年首次记述了BNC1的启动子甲基化，主要在肺，乳腺，结肠和前列腺癌组织被频繁发现，这表明BNC1甲基化可能是上皮癌的常见标记。据研究所知，胰腺癌是唯一一个对BNC1启动子甲基化进行分析并在血清中发现的癌症[15]。

NPTX2是一种由位于7号染色体上的NPTX2基因编码的突触蛋白。NPTX2是正五聚蛋白家族的一部分，还包括c反应蛋白。NPTX2广泛分布在各组织:大脑、睾丸、胰腺、肝脏、心脏和骨骼肌。NPTX2参与了兴奋性突触的形成，并在帕金森病中被发现[16]。NPTX2的致癌作用还没有完全被了解。然而，对胰腺癌细胞系的研究表明，NPTX2的表达明显促进了g0/g1的抑制和细胞凋亡，并减少了细胞增殖、迁移和入侵，这表明NPTX2在胰腺癌的形成中起到了肿瘤抑制基因的作用。NPTX2的启动子超甲基化在胰腺癌组织中被发现，甚至在癌前病变（PanIN）中，也已经被证实NPTX2启动子的甲基化作用随着异常增生程度的增加而增加；与正常的胰腺组织或相邻的正常组织相比，NPTX2信使RNA的表达在胰腺癌细胞系和胰腺癌组织中较低。正常胰腺组织中NPTX2基因的启动子区域大部分都是未甲基化的，5-aza-dc的作用使NPTX2基因启动子区甲基化导致了NPTX2信使RNA的表达，这表明启动子区高甲基化是NPTX2信使RNA表达下调的主要原因，是胰腺癌早期肿瘤发生的环节之一[17]。在一些细胞系中，加用组蛋白脱乙酰酶治疗可以进一步增强NPTX2信使RNA表达，表明NPTX2信使RNA的表达下调不仅可以由启动子区超甲基化，还可以由一个复杂的表观遗传变化引起。在胰腺癌患者的胰腺液中已经发现了NPTX2的超甲基化。与ADAMTS1和BNC1一样，NPTX2的启动子超甲基化已经被研究可作为胰腺癌一种血液标记[18]。

ppENK是一种蛋白质编码基因。从前体蛋白原基素（PENK）烯酮和其他肽类物质，如神经递质、自分泌和旁分泌因子中产生的，作用于与阿片受体密切相关的配体，通过增加局部缺血的耐受性，其具有心血管保护功能。ppENK信使RNA在许多组织中都很丰富[19]。据研究所知，其异常的启动子超甲基化只与胰腺癌有关。ppENK高甲基化已经在癌前病变、皮内乳头状瘤（IPMNs）、PanIN中被发现，而且在 IPMNs病人手术或内镜中收集的胰腺液中被检测到。恶性度高的IPMNs比恶性度低的IPMNs组织中（82%和28%）甲基化更加频繁，并且DNA的高甲基化与ppENK信使RNA表达的丢失有关。同样地，恶性度高的PanINs中ppENK的高甲基化更常见，这表明ppENK高甲基化能促进癌前病变的发展和进展。ppENK的高甲基化也在胰腺癌组织样本和胰腺癌患者的胰腺液中被检测到，并且正常的胰腺组织中ppENK基因未甲基化并显示正常的ppENK信使RNA表达，然而，在慢性胰腺炎和健康个体的胰液中也发现一些ppENK高甲基化。胰腺癌细胞系已被证实具有ppENK的高甲基化和ppENK信使RNA的不表达。通过应用甲基化剂5-aza-dc对胰腺癌细胞株的治疗逆转了ppENK信使RNA的表达，并减少了在G1期细胞的增殖和增加，这说明ppENK启动子的甲基化作用在某种程度上促进了胰腺癌的形成[8]。

p16[细胞依赖性激酶抑制剂 2A（CDKN2A）]是一种由CDKN2A/P16基因编码的肿瘤抑制蛋白，该基因位于9号染色体上。p16蛋白质具有肿瘤抑制功能，在调节细胞周期中起着重要作用，它与CDK4-CDK6相结合，导致了G1期细胞周期的停止。在不同类型的癌症组织（如胰腺癌、胃癌、白血病、食道癌、鼻咽癌、RCC、CRC、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等）中均发现p16的超甲基化，甚至在各种癌症患者的血清和血浆中也观察到。在胰腺癌患者的血浆中，p16的启动子高甲基化已经被发现[20]。

2.在胰腺癌中DNA甲基化的临床应用

大量研究表明，在所有的表观遗传变异中，DNA异常甲基化抑制了特定肿瘤抑制基因的启动子区域的转录，导致基因沉默或激活，这种基因组的不稳定性造成染色体的丢失。广泛的证据表明，DNA甲基化在胰腺癌的发展和进展中起着关键的作用，但是，在胰腺肿瘤中甲基化的临床应用是有限的。DNA超甲基化在胰腺癌早期即发生，所以DNA甲基化程度的测试可以用于早期癌症的分子检测[21-23]。有家族病史或癌前病变例如IPMN的患者可看作是胰腺癌发生的高危患者。由于缺乏有效的筛选试验，而且外科手术切除也与发病率有显著的关联，所以这些病人的临床治疗极具挑战。因此，迫切需要一个能对这些患者的风险分层进行评估的分子诊断试验，临床实验已经评估了甲基化定量试验的作用，例如甲基化特异PCR（MSP）在对有家族病史的胰腺癌患者的诊断。这些试验主要是对胰液进行评估，它的特异性和敏感性还没有被证实。然而，随着检测甲基化的技术的改进，这些测试有可能取代目前的筛选模式。DNA甲基化是癌症的一种预兆，所以它可以用于癌前病变和恶性疾病的危险分层，也可以作为一个评估癌症风险的工具[24-26]。

3.DNA甲基化与胰腺癌的治疗

目标甲基化可以逆转抑制基因表达。药物如5-氮杂胞苷和5-aza-2-脱氧胞苷（地西他滨）或天然产物如燃料木黄酮或姜黄素可以通过抑制DNMT影响DNA甲基化，另外，伴侣蛋白如热休克蛋白（Hsp90）可以通过抑制DNMT的转运或者反义DNA甲基转移酶和RNA干扰 （RNAi）通过抑制DNMT的转录来影响DNA甲基化[27]。在临床前模型中证实，对DNA甲基化的抑制可以导致像富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白（SPARC）这样的抑制基因的表达，SPARC的表达可以抑制肿瘤生长，改变化疗药物的敏感性[28]。这些治疗策略在临床前期是很有发展的，但是他们在临床上的应用是有限的，他们的潜在用途包括预防使用天然化合物或与放疗、化疗或其他靶向制剂结合使用。

四、结论

DNA甲基化对胰腺癌的发生、发展均起着重要作用。随着对DNA甲基化的进一步研究，对胰腺癌的发生机制也会有更深入的了解，为胰腺癌的早期诊断、预测复发、评估预后及靶向治疗等方面提供了新的方法和途径，其未来的研究前景必将更加广阔。