微生物学

秦楠，栗东芳，杨瑞馥

高通量测序技术及其在微生物学研究中的应用

秦楠，栗东芳，杨瑞馥

20世纪70年代，由Frederick Sanger发明的双脱氧链终止法核酸测序技术，为科学发展做出了重要贡献，成就了人类基因组的完成。Sanger测序法也被称为第一代测序技术，它的原理是以 DNA单链为模板，进行 PCR扩增，扩增体系中加入的碱基为 dNTP和荧光ddNTP，对得到的不同长度产物进行电泳分离和激光诱导荧光颜色区分，经过信息转换，获得长达 800 bp的DNA链碱基组成序列。该方法已经在PCR产物、载体克隆测序等方面得到广泛应用，但其成本高和测序通量低的缺陷，限制了该方法在大规模测序中的应用。新一代测序技术（next-generation sequencing technology，或被称为第二代测序技术）以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表。这些测序平台以数据产出通量高为最大特点，以Solexa技术为例，采用了该技术的Hiseq 2000测序仪，一台机器在两周内就可以产出超过300 G的数据，相当于把人类基因组重复测 100遍以上。这完全改变了过去的研究模式，给人类和动植物基因组学、转录组学、宏基因组学研究等方面带来全新的变化，并逐步深入到微生物学研究领域中。本综述旨在介绍代表性的高通量测序技术，同时着重阐述该技术在微生物学研究中的应用。高通量测序技术领域的发展，使得核酸序列的测定速度与成本价格的比值，以超过摩尔定律的速度迅速增加。因此，全基因组（转录组）序列测序技术将不可避免地像PCR技术那样，走入每一个分子生物学实验室，成为微生物学家们的常规研究手段。而高通量测序技术所带来的基因组学和转录组学研究的变革，会为蛋白质组学 和代谢组学奠定基础，它们将共同成为系统微生物学发展的基石。但问题和挑战依然存在。首先，随着核酸序列数量上的跨越式累积，生物信息学分析将面临巨大的挑战，适用于常规实验室使用的新统计学方法和分析软件的开发成为当前的迫切需求。另外，海量数据的深入挖掘工作会发现用传统生物学理论难以解释的生命规律，对传统理论的颠覆和新理论的提出与建立将成为不可避免的工作。

来源出版物：微生物学报, 2011, 51(4): 445-457

入选年份：2015

我国禽流感研究进展及成就

张毅，王幼明，王芳，等

摘要：禽流感不仅严重危害养禽业，而且给公共卫生造成巨大威胁。为了科学认识和积极防控禽流感，我国科学家进行了大量且富有成效的研究，取得了举世瞩目的成果。1996年，中国农科院哈尔滨兽医研究所从广东一个鹅场分离到 H5N1亚型禽流感病毒，命名为A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），这是我国第一次分离到高致病性禽流感病毒。流行病学调查分析表明，近些年来在我国的鸡群中流行的H5N1亚型禽流感病毒主要属于 Clade2.3.2、Clade2.3.4和 Clade7。1994年陈伯伦等人首次从我国广东某鸡场发病鸡体内分离到 H9N2亚型病毒，目前我国大陆地区的鸡群中主要流行Y280-like和G1-like两个分支的H9N2亚型禽流感病毒。通过长期的监测，基本掌握了禽流感在我国的流行情况和进化规律。利用反向遗传和定点突变操作技术，已证实H5N1亚型禽流感病毒PB2蛋白D701N的突变，HA蛋白裂解位点P6位丝氨酸的突变，NS1蛋白P42S的突

变均与病毒对哺乳动物的致病力增强有关。Shi等首次解析了 H7N9病毒的 HA蛋白的晶体结构，并解释了H7N9病毒为何会感染人类及HA蛋白226位在结合人类上呼吸道α-2，6唾液酸受体中所起的作用。利用先进的生物技术，发现了影响流感病毒致病力、传播力和受体结合能力的部分关键位点，阐释了其作用机制。目前我国已建立了成熟的H5、H7、H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR的国家检测标准，LAMP-PCR等改进的PCR方法也已应用于禽流感的检测，Han等利用 DNA芯片技术，设计针对16种不同HA亚型和9种不同NA亚型的核酸探针，可以一次性快速鉴别出分离到病毒属于何种亚型。通过对传统技术的改进和先进方法的应用，不断成功建立禽流感诊断、检测技术。Liu等以鸭肠炎病毒为载体构建了 H5亚型病毒的活载体疫苗，Fan等利用反向遗传操作技术，构建了H5N1病毒减毒冷适应活疫苗。新型禽流感疫苗不断涌现并逐步被推广和应用，取得了良好的免疫效果。上述成果为我国禽流感的防控奠定了良好的基础，也为后续研究提供了依据。但是禽流感的防控形势依然严峻，新型H7N9病毒的出现，使禽流感的防控面临新的挑战。

来源出版物：微生物学通报, 2014, 41(3): 497-503

入选年份：2015