感染性疾病学、传染病学

肺炎克雷伯菌携带碳青霉烯酶KPC-2的基因环境的多态性研究

沈平华，仉英，蒋晓飞

摘要：目的：KPC（Klebsiella pneumoniaecarbapenemases）是导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的主要原因，而KPC-2是KPC中最常见的类型之一。中国地区已经报道的关于KPC-2的耐药基因分别位于肺炎克雷伯菌中的pKP048和pKPHS2质粒上，通过对质粒全基因测序发现了两种携带blaKPC-2的基因环境：pKP048（GenBank accession no：FJ628167.2）的耐药基因位于一个完整的Tn1721样转座子中；pKPHS2（GenBank accession no：CP003224.1）上的基因环境为Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26样的新结构，即Tn1721结构被IS26在Tn3的tnpR处打断，造成tnpATn3和IRL2Tn1721的丢失。blaKPC-2的基因环境是了解blaKPC-2播散途径的重要信息，是进行有效的院感控制的基础。本研究将华山医院自第一株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌检出到该耐药细菌广泛播散的这段时期内耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌作为一个完整的样本，运用PCR及测序获得携带blaKPC-2的完整的基因结构及侧翼序列，希望为下一步深入研究该耐药基因的播散机制提供全面的基因背景。方法：收集华山医院自2006年8月—2009年12月连续不重复的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，共42株。运用引物KPC-FOR：5'-TCGCTAAACTCGAACAGG-3'和KPCREV：5'-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3'，以抽提的质粒为模板，对42株细菌进行blaKPC-2筛选。随后进行多位点序列分型（MLST）。根据pKP048和pKPHS2的序列，设计了一系列PCR引物进行扩增与测序，分别用于检测本批菌株中是否存在与上述已经报道的blaKPC-2的基因环境相同的结构。结合后续的crossing PCR可以覆盖整个基因环境的序列。PCR阳性产物送上海迈浦生物科技有限公司纯化后测序。根据Junction PCR与Mapping PCR的结果，当出现区别与以上两种结构的新结构时，拟运用代表性质粒测序及以纯质粒为模板进行PCR walking等方法，获得整个新结构的完整基因环境的序列。结果：42株肺炎克雷伯菌MLST分型显示：5株属于ST423，2株属于ST65，1株属于ST977，34株均属于ST11型。展示了所有菌株携带blaKPC-2的基因结构及该结构两侧的序列。本批菌株检测到了与pKP048和pKPHS2不同的blaKPC-2的基因环境。A型为Tn1721-blaKPC-2-Tn3样结构，显示具备与pKP048相似的blaKPC-2的基因环境，但该机构上下游序列分别为parA基因和DNA distortion protein 3-like基因，而不是Tn1721的IRL2。A型结构，分别位于ST423、ST65、ST97型菌株中。B结构的质粒均位于ST11型菌株中。B1型显示具有与pKPHS2相同的blaKPC-2的基因环境，即Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26。且该结构外围也具备相同的基因结构。B2型与B1型相比唯一的区别是J1阴性，以纯质粒为模板，运用引物2R向一侧Walking。该型Tn1721的IRR上游序列与K.pneumoniaJM45 plasmid p2（GenBank accession no：CP006658.1）上的一个功能未知的蛋白序列高度一致，与△IS26无相似性。B2与B1结构中IS26的下游均连接着TniA基因。结论：华山医院自碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌爆发初期，即存在blaKPC-2基因环境的多态性，提示其blaKPC-2播散可能存在不同的来源。尤其B1与B2存在不同的侧翼序列，推测该结构是一种新型的嵌合型可移动元件，可能具备水平转移的能力，转移过程中发生了不同位置的插入。本文在研究方法上也有一定的创新。克服了运用全质粒测序后获得携带blaKPC-2基因环境费时费力及难以进行大样本分析的弊端；同时以往的研究中，通常只是分析blaKPC-2上下游的一小段序列，完整展示了携带blaKPC-2基因环境，为进一步分析该结构可能的移动模式和机制提供了有价值的基因背景。鉴于本文的局限性，下一步拟在菌株收集的时间和种类上进一步扩展，以获得华山医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌携带blaKPC-2的基因环境，为控制医院感染提供有价值的信息。总之，华山医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的主要流行株为ST11型，且临床数据显示携带耐药基因blaKPC-2的基因环境存在多态性，提出该耐药基因的水平播散可能存在不同的机制，为下一步研究该耐药基因的水平播散模式和机制奠定了研究基础。

来源出版物：中国感染与化疗杂志, 2016, 16(6): 680-684

入选年份：2016

发热门诊血流感染154例病原学分析

李晓光，胥婕，姚贝

摘要：目的：通过分析发热门诊血流感染患者常见病原菌的分布和药敏情况，为社区获得性血流感染（BSI）的经验性治疗提供依据。方法：通过检索北京大学第三医院检验系统中2009年1月—2013年12月发热门诊的血培养化验单，对血培养阳性结果逐一人工查阅病历。对临床考虑为一次感染过程中多次血培养阳性且为同一细菌者只收录首次血培养结果，对于同一患者血培养为多种细菌者，分析为致病菌或污染菌的可能性后再纳入。血流感染的诊断标准参照《2001年中华人民共和国卫生部医院感染诊断标准（试行）》。污染菌的判定参考美国CDC 1996年医院感染诊断标准，常见的皮肤寄殖菌如类白喉杆菌、杆菌属、丙酸杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、微球菌考虑污染菌可能。对于凝固酶阴性葡萄球菌，如果在培养72 h以上报警或者单次培养阳性者不计入统计。最终154例患者纳入研究，分析其病原学特点。结果：2009年1月—2013年12月发热门诊就诊患者中1267例行血培养检查，166例患者培养出菌株177株，9株为重复培养，1例患者同时培养出大肠埃希菌和表皮葡萄球菌，1例患者同时培养出大肠埃希菌和芽孢杆菌，考虑表皮葡萄球菌和芽孢杆菌为污染菌。结合血培养报警时间大于72 h和培养出的菌种，另确定12株污染菌，包括葡萄球菌、棒状杆菌、芽孢杆菌，故实际纳入研究菌株154株（12.2%，154/1267）。154例患者中，男80例（51.9%），女74例（48.1%）。患者的平均年龄（57±20）岁，65岁以上为老年组有68例（44.2%，68/154）。与中青年组比较，老年组患者中男性比例更高，差异有统计学意义（χ2＝4.701，P＝0.030）。有明确感染灶者68.2%，主要为肺部感染、急性肾盂肾炎、肠道感染、胆道感染、腹腔感染、肝脓肿等，多部位感染10例（6.0%）。血培养结果最终纳入研究病原菌154株，其中革兰阴性菌127株（82.5%），革兰阳性菌27株（17.5%）。革兰阴性菌的报警时间（time to positivity）：需氧培养（13.8±15.6）h，厌氧培养（13.3±16.2）h；革兰阳性菌的报警时间：需氧培养（16.9±9.5）h，厌氧培养（17.6±18.9）h；2种菌的报警时间差异无统计学意义（P＞0.05）。大肠埃希菌的报警时间，需氧培养（14.9±14.3）h，厌氧培养（15.6±17.7）h。检出病原菌第一位是大肠埃希菌82株（53.3%），其次是肺炎克雷伯菌19株（12.3%）、沙门菌属15株（9.7%）、链球菌属13株（8.4%）、凝固酶阴性葡萄球菌8株（5.2%）。大肠埃希菌对碳青霉烯类药物敏感率100%，对哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮-舒巴坦的敏感率80%以上，对头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南的敏感率在60%～79%，对头孢呋辛、头孢曲松、左氧氟沙星的敏感率50%～60%。分析临床经验治疗，病原菌对首选药物89.2%呈现敏感。结论：发热门诊社区获得性血流感染患者病原菌种类多样，以革兰阴性菌为主，第一位是大肠埃希菌；对多数患者而言，第三代头孢菌素、喹诺酮类药物经验治疗有效。

来源出版物：中国感染与化疗杂志, 2016, 16(2): 123-128

入选年份：2016