几种因素对悬浮培养白色紫锥菊不定根生物量和有效物质积累的影响

王洪秋　李贺　吴春华

摘要：为优化白色紫锥菊不定根悬浮培养体系，从而获得较多有效物质的积累，以白色紫锥菊不定根为试验材料，探究培养基中PO43-浓度、总氮浓度、NO3--NH4+对白色紫锥菊不定根生物量及有效物质积累的影响。结果表明：当培养基中PO43-浓度为0.94 mmol/L、总氮浓度为45 mmol/L、NO3--NH4+为37.5-7.5 mmol/L时，悬浮培养白色紫锥菊不定根生物量及有效物质均达到最大值，其中酚、黄酮生产量分别为253.78、178.08 mg/L。因此，通过调节培养基成分配比，可提供生物量及有效物质含量高的不定根为原材料，为进一步大规模培养白色紫锥菊不定根奠定了理论基础。

关键词：悬浮培养；白色紫锥菊；不定根；酚；黄酮；生物量；有效物质积累

中图分类号： S682.1+10.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0125-03

白色紫锥菊（Echinacea pallida）属菊科松果菊属，多年生草本植物，为原产于北美地区的一种药用植物[1]，它被国际公认为免疫增强剂[2]。白色紫锥菊作为中草药使用，相对于其他药用植物比较安全[3]，它的药用功效主要为抗炎、抗菌、抗病毒、增强免疫等。白色紫锥菊含有酚类、黄酮类、咖啡酸类衍生物、多种烷基酰胺类化合物、挥发油、多糖等多种有效活性成分。其中，含有的多酚类物质具有抗炎活性，可以抑制透明质酸酶和环氧合酶等酶类，阻断前列腺素的合成，从而减少炎症细胞的入侵。多酚类物质也能通过清除活性氧，使自由基不损伤皮肤胶元蛋白[4]。此外，白色紫锥菊中还含有它特有的紫锥菊苷，具有治疗糖尿病、抗肿瘤、抗衰老等作用，还对肺癌、肝癌和胃腺癌有显著的疗效[5-6]。

栽培的白色紫锥菊易受不同地区和生长期等栽培条件的影响，其产量及品质难以满足需求[7]。利用植物组织培养手段培养的不定根遗传稳定性高、有效物质含量稳定，具有较高的安全性[8]，不定根培养成为快速获得药用植物活性成分的有效方法。因此，很多研究都采用这一方法进行有效物质的生产。姜银姬等探究了东北刺人参不定根培养方式，发现悬浮培养与固体培养相比较，具有更高的皂苷含量积累[9]。在紫锥菊不定根培养方面，吴春华等研究了白色紫锥菊不定根培养基中无机盐和蔗糖的浓度[10]。但白色紫锥菊不定根培养体系尚未完善。因此，本研究探究了磷浓度、总氮浓度和NO3--NH4+对不定根生长以及有效物质积累的影响，为今后以培养的不定根作为白色紫锥菊产品开发及生产的原材料提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

从大连市农业科学研究院获得白色紫锥菊不定根，2016年7月在延边大学农学院将其接种于[3/4 MS+IBA（吲哚丁酸）1 mg/L+蔗糖50 g/L+琼脂6.8 g/L，pH值 5.8][10]固体培养基中，从而进行增殖培养。培养条件为：暗处理，培养温度为（25±1）℃。暗培养30 d后，取新鲜不定根切成大小约为1 cm的小段，作为试验材料。

1.2试验方法

1.2.1几种因素对白色紫锥菊不定根生物量和有效物质积累的影响

为探明培养基中PO43-浓度、总氮浓度、NO3--NH4+对悬浮培养白色紫锥菊不定根增殖生长和有效物质积累的影响。称取白色紫锥菊不定根0.35 g鲜质量（FW），接种于150 mL錐形瓶中，其中含有50 mL液体培养基。

PO43-浓度试验：将培养基中PO43-浓度分别设为0、0.31、0.63、0.94、1.25、1.56、1.88 mmol/L，培养基中IBA为 1 mg/L、蔗糖为50 g/L，pH值5.8。振荡器转速为 100 r/min，进行暗培养，培养温度设定为（25±1）℃。30 d 后测定白色紫锥菊不定根的鲜质量、干质量以及酚和黄酮的含量，并计算其生产量。

总氮浓度试验：将培养基中总氮浓度分别设置为0、15、30、45、60、75、90 mmol/L，培养基其他成分及培养条件与PO43-浓度试验相同。

NO3--NH4+试验：固定培养基中总氮浓度为 45 mmol/L，将培养基中NO3--NH4+分别设为0-45、7.5-37.5、15-30、22.5-22.5、30-15、37.5-7.5、45-0 mmol/L，培养基其他成分及培养条件与PO43-浓度试验相同。

1.2.2不定根生物量的测定

收获悬浮培养30 d的不定根，将其用自来水冲洗干净后，再用滤纸吸干表面水分，称其质量即为鲜质量（FW）。然后将不定根放入烘干箱中，55 ℃烘干48 h，使不定根干燥至恒质量，称其干质量（DW）。

1.2.3有效物质的萃取

称取0.2 g干燥的白色紫锥菊不定根，然后加入10 mL的80%甲醇。在常温下，用磁力搅拌器进行15 min萃取，然后离心10 min，将过滤后的上清液倒入容量瓶中，残渣再次用同一方法萃取分离，最后定容至 25 mL，用于测定有效物质含量。

1.2.4酚含量的测定

福林法（folin and Ciocalteu）：精确称取没食子酸25 mg，以蒸馏水为溶剂，定容至250 mL。标准曲线浓度为0.1 mg/mL，分别取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL标准溶液和0.1 mL萃取液于试管中，加入蒸馏水至2.6 mL，以蒸馏水作为空白对照，再加入0.1 mL福林酚指示剂，摇匀静止6 min后，加入0.5 mL的20% Na2CO3。在常温下，30 min暗反应，在760 nm处用紫外分光光度计测定其吸光度。

1.2.5黄酮含量的测定

儿茶素（catechin）标准液法：精密称取儿茶素0.04 g，加蒸馏水定容至50 mL，标准曲线浓度为0.8 mg/mL，然后分别取0.19、0.38、0.56、0.75、0.94、1.13、1.31、1.50 mL标准溶液和0.25 mL萃取液于试管中，加蒸馏水至1.5 mL，蒸馏水作为空白对照，再加入0.75 mL的5% NaOH2溶液，摇匀静止6 min后，加入0.15 mL的10% AlCl3溶液，待反应5 min后加入0.5 mL的1 mol/L NaOH溶液，在510 nm处用紫外分光光度计测定其吸光度。endprint