烟草黑胫病拮抗细菌的筛选及其发酵条件优化

尹福强　刘铭　蔡艺梅

摘要：为获得对烟草黑胫病有较强生防效果的拮抗细菌，从四川省凉山州5个县（市）烟草种植田地采集10份土壤样品，通过稀释平板法分离得到112株细菌。采用平板对峙法获得39株对烟草黑胫病病原菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）拮抗效果较好的细菌。选取拮抗效果最好的GC-38菌株进行进一步研究，结果显示，菌株GC-38对烟草黑胫病病菌抑制率为81.81%，经鉴定菌株GC-38为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliauefaciens）。优化后得到其最佳发酵条件：碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨，pH值为9.0，温度在30～35 ℃范围内。可见，GC-38菌株对烟草黑胫病有明显的拮抗作用，是具有较大开发潜能的生防菌株。

关键词：烟草黑胫病；拮抗细菌；抑菌率；发酵条件；生物防治

中图分类号： S435.72文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0096-03

烟草是我国重要的经济作物之一，近年来，烟草黑胫病逐渐成为仅次于烟草病毒病的第二大烟草病害，每年造成的经济损失平均均为1亿元[1-2]。烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引发的经土壤传播的真菌性病害，主要发生在烟草成株阶段，在苗床期发生较少，烟草黑胫病常年发病率为10%～15%，严重时发病率高于80%，甚至绝收，给烟草生产带来严重的威胁。

对烟草黑胫病的防治，目前主要集中在化学防治方面[3]。但化学防治可造成环境污染，且容易产生抗药性[4]。相对于化学防治而言，生物防治具有成本低、有效期长、不污染环境、对人畜安全、病害不易产生抗性、可减少化学农药用料、节约能源等优点。本研究从烟草根际土壤中分离筛选出有益细菌，筛选拮抗效果较好的菌株，然后对其进行鉴定，研究其生长曲线及发酵条件，为更好地利用该菌株奠定基础，同时为黑胫病的生物防治提供资源。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌种

烟草疫霉（P.parasitica var. nicotianae），由西昌学院植物保护实验室提供。

1.1.2供试土壤样品

采自四川省凉山州会理县、普格县、盐源县、冕宁县、西昌市5个县（市）烟草黑胫病发病严重的健康烟草植株的根际土壤。

1.1.3供试培养基

PDA培养基、燕麦培养基、NA液体培养基，培养基配方均参照《微生物及其应用》[5]。

1.2试验方法

1.2.1拮抗细菌的分离

采用稀释平板法分离拮抗细菌。在健康烟草植株的根际采集土壤样品，采用5点法取样，每点取20 g土壤样品，每块烟田中共取100 g土壤样品。5个县（市）的取样点共取10份土壤样品，分别将每份土壤样品充分混匀后称取10 g装入10个三角瓶中，并加入适量提前灭菌的玻璃珠和90 mL无菌水，将三角瓶振荡20 min，静置 5 min 后取其上清液。最后用无菌水将上清液稀释成浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8悬浮液，本试验取用10-6、10-7、10-8悬浮液，在超净工作台上用三角玻璃棒将上清液均匀涂抹于NA平板上，28 ℃ 恒温培养1～2 d。待菌落长出后，将单菌落逐个挑出转接于试管中，进行纯化培养并编号。

1.2.2拮抗细菌的筛选

以烟草黑胫病病菌作为病原菌，采用对峙划线法测定拮抗细菌对病原菌的拮抗作用，用直径为 5 mm 的打孔器打取病原菌菌饼，接种于PDA平板中心，用接种环挑取供试拮抗细菌于距平板中央约3 cm处划1条贯穿培养皿的菌线，以接种病原菌菌饼不接拮抗菌的PDA平板作为对照，在28 ℃恒温培养，产生抑菌效果后，用游标卡尺测量菌落半径，计算抑菌率。

抑菌率=（对照组病原菌菌落半径-处理组病原菌菌落半径）/对照组病原菌菌落半径×100%。

选出对病原菌有拮抗效果的菌株，再以相同的方法进行复筛，每个菌株3次重复，从中选出拮抗效果最好的1株菌株，用于發酵条件的优化试验。

1.2.3拮抗细菌的鉴定

采用划线培养法将筛选出的拮抗效果最好的细菌菌株接种至NA平板上，35 ℃倒置培养1～2 d，通过细菌的形态特征及生理生化特征进行初步鉴定。鉴定方法参考《伯杰氏细菌鉴定手册》[6]和《常见细菌系统鉴定手册》[7]。

1.2.4拮抗细菌菌株种子液制备

从筛选出的拮抗效果最好的细菌菌株斜面上挑取1环培养物接种于50 mL NA液体培养基中，于35 ℃、140 r/min振荡培养12 h得到拮抗细菌种子液。

1.2.5生长曲线的测定

将细菌菌株种子液以4 mL的接种量接入250 mL的NA液体培养基中，35 ℃、140 r/min振荡培养，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48 h取出2 mL培养液测其D600 nm，绘制生长曲线。

1.2.6发酵条件优化

NA培养基中分别含有蛋白胨和葡萄糖，为使发酵条件得到优化可以在其他培养基配方不变的基础上，分别用其他可用氮源、碳源将蛋白胨、葡萄糖换掉。本试验能够使用的氮源有硝酸铵、硝酸钾、氯化铵和硝酸钠，可使用的碳源有蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和麦芽糖。通过对氮源、碳源的更换分别制成了不同氮源、碳源的培养基。改变温度、pH值，以4 mL的接种量将种子液接入到250 mL不同培养基中，140 r/min振荡培养，测其D600 nm，得到拮抗细菌的最适发酵条件。

2结果与分析endprint

2.1烟草黑胫病根际拮抗细菌的筛选

用稀释平板法分离并得到了112株细菌，采用平板划线对峙法分别接种病原菌和细菌。首先取5 mm病原菌菌饼接种于PDA平板中央，再用划线法在距平板中心约3 cm处将细菌接种于平板上，28 ℃倒置培养6 d后观察抑菌效果，计算抑菌率。由表1可知，有抑菌作用的菌株共39株，占3482%，这39株拮抗菌对病原菌的平均抑制率为64.57%，拮抗效果最好的菌株是GC-38，其抑菌率高达81.81%。

2.2菌株GC-38的鉴定

GC-38菌株在NA培养基上菌落为乳白色至淡黄色，菌落直径2～3 mm，圆形，周围不规则，表面不光滑，有皱纹。显微镜下观察，菌体呈杆状，直或接近直，（0.3～2.2） μm×（1.2～7.0） μm，多数运动，鞭毛典型侧生。由表2可知，GC-38菌株的革兰氏染色、葡萄糖、蔗糖、氧化酶、接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、甲基红、伏-普反应（V-P）、明胶液化和柠檬酸盐试验结果均为阳性，而吲哚、乙醇氧化、乙酸试验结果均为阴性。菌株GC-38的形态及生理生化特性与解淀粉芽孢杆菌最为接近，经鉴定，GC-38为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliauefaciens）。

2.3生长曲线的绘制

由图1可知，GC-38菌株的生长曲线基本呈“S”形，0～12 h 其生长较为平缓，为延迟期；12～33 h菌株生长相对于 0～12 h要快很多，为对数生长期；在33～42 h菌株基本停止生长，为稳定期；42 h后菌株不再生长甚至出现死亡的现象，此时为衰亡期。该菌株在对数生长期生长迅速，代谢比较强，生命力强，最适合用作种子液，因此，选取12 h时的发酵液作为种子液。

2.4GC-38菌株发酵培养基的优化

2.4.1pH值对GC-38菌株生长的影响

将GC-38菌株的种子液按4 mL的接种量分别接种于初始pH值分别为6、7、8、9、10、11、12，装液量为250 mL的发酵培养基中，于 140 r/min、35 ℃恒温振荡培养20 h，测定其D600 nm。由图2可知，pH值为9时，GC-38菌株的D600 nm最高，即菌株生长量较大。因此，GC-38菌株发酵的最适pH值为9。

2.4.2温度对GC-38菌株生长的影响

将GC-38菌株的种子液按4 mL的接种量接种到250 mL、pH值为9的基础培养基中，分别在15、20、25、30、35、40、45 ℃条件下，140 r/min振荡培养20 h，测定其D600 nm。由图3可知，温度为30～35 ℃时，GC-38菌株的生长量较大，因此，最适温度范围为30～35 ℃。

2.4.3碳源筛选

将GC-38菌株的种子液按4 mL的接种量接种到250 mL、pH值为9的碳源培养基中，140 r/min、35 ℃ 恒温振荡培养20 h，稀释20倍测定其D600 nm。由图4可知，以葡萄糖为碳源对GC-38菌株生长量的作用最大，因此，确定最适碳源为葡萄糖。

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2.4.4氮源筛选

将GC-38菌株的种子液按4 mL的接种量，接种到250 mL、pH值为9的氮源培养基中，140 r/min、35 ℃ 恒温振荡培养20 h，测定其D600 nm。由图5可知，蛋白胨为氮源时菌株的D600 nm最高，即菌株生长量最大，因此，确定最适氮源为蛋白胨。

3讨论

20世纪90年代以来，越来越多的人开始关注生物防治，用于生物防治的微生物有很多，主要包括真菌、细菌、放线菌、病毒等。易龙等从烟草病株提取出对烟草赤星病病菌有明显抑制作用的拮抗内生细菌Ttb162[8]。刘鑫海等从甜瓜表面分离得到的假单胞菌对甜瓜枯萎病的生防效果较好[9]。唐圣华等从烟草根际土壤中分离得到的1株枯草芽孢杆菌对烟草赤星病有较好的防效[10]。

近年来，芽孢杆菌用于病害防治的研究较多，某些芽孢杆菌不仅能防病而且在防病的同时还能促进作物的生长，使作物的产量得到显著的增加[11-12]。朱晓飞等从土壤中筛选出的解淀粉芽孢杆菌对水稻纹枯病的抑制率高于70%[13]。本研究筛选的GC-38解淀粉芽孢杆菌对烟草黑胫病具有较好的抑菌活性，这在此前还未见报道，但解淀粉芽孢杆菌对烟草黑胫病病原菌的抑制机理及大田防治效果还有待进一步研究。

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