芳香烃受体信号通路在皮肤肿瘤中的表达

潘展砚　陈佳　胡婷婷等

[摘要]目的：探索正常皮肤、目光性角化（AK）、鲍温病和皮肤鳞状细胞癌（SCC）组织中芳香烃受体通路相关蛋白AHR及CYP1A1的表达。方法：采用免疫组织化学法检测15例正常皮肤，10例AK，10例鲍温病以及20例皮肤SCC中AHR及CYP1A1蛋白表达情况。结果：AHR在正常皮肤、AK、鲍温病和皮肤SCC中表达于细胞浆和细胞核，阳性率分别为33%，100%，80%，65%；AHR在细胞核表达中阳性率分别为20%，70%，60%，50%；CYP1A1在正常皮肤、AK、鲍温病和皮肤SCC中表达于细胞浆，阳性率分别为20%，20%，20%，15%。结论：AHR的高表达和激活与皮肤SCC的发生有关，值得进一步研究其在皮肤肿瘤中的作用。

[关键词]芳香烃受体；AK；鮑温病；鳞状细胞癌

[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）08-0080-03

芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR），又称为二噁英受体，是一种配体激活的转录因子，可以激活外源性代谢酶细胞色素P450家族（CYP），调节多种环境污染物如二噁英（TCDD）和多环芳烃类（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）在细胞内的代谢过程。AHR参与环境污染物的代谢，会导致某些致癌中间代谢物的产生，从而引起肿瘤的产生。最新研究显示，AHR可以被中波紫外线激活，并对细胞增殖、凋亡和炎症因子产生影响，从而参与日光性皮肤肿瘤的发生。

虽然有细胞和动物研究推测AHR的表达和激活与皮肤肿瘤的形成有关，但AHR与临床皮肤肿瘤的相关性研究还未见相关报道。本研究拟通过免疫组织化学技术分析AHR在正常皮肤、日光性角化病（actinic keratosis，AK）、鲍温病（Bowen Disease）、皮肤鳞状细胞癌（Squmous cell carcinoma，SCC）的表达差异。

1材料和方法

1.1标本来源：标本来自于上海市皮肤性病医院2013年1月2015年7月活检存档蜡块，其中正常皮肤15例，AK标本10例，鲍温病10例，皮肤SCC20例。以上标本均经病理检查及免疫组织化学检查证实，且所有病例病理检查均未经过化疗、放疗及其他免疫治疗。

1.2试剂：兔抗人AHR抗体和CYP1A1抗体购买自美国Santa Cruz Biotechnology公司；即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒（鼠/兔）、粉剂型柠檬酸抗原修复液、粉剂型PBS磷酸盐缓冲液购自福建迈新公司。

1.3免疫组织化学染色：将所有标本以4μm厚度连续切片，将组织切片常规脱蜡。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照；用试剂公司提供的已知阳性切片作为阳性对照。所有标本用柠檬酸修复抗原，滴加一抗，37℃孵育60mim PBS缓冲液冲洗3min×3次；滴加二抗，室温孵育30min，PBS缓冲液冲洗3min×3次；滴加新鲜配制的DAB显色，镜下控制显色时间，及时终止显色；依次苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，风干，树脂封片。

1.4结果判定：染色结果判定以胞浆、细胞核现清晰的黄褐色至黄色颗粒者为阳性。按400倍视野阳性细胞百分值（0%：0分；1%～25%：1分；26%～50%：2分；>50%：3分）和细胞着色强度（阴性：0分；淡黄色：1分；棕黄色：2分；棕褐色：3分）评分。两分值相加，0～2分为阴性，3～6分为阳性。

1.5统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行相关分析，正常皮肤的阳性率与三种皮肤肿瘤的阳性率比较采取2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 AHR在正常皮肤、AK、鲍温病和皮肤SCC中的表达测定结果：AHR在正常皮肤、AK、鲍温病和皮肤SCC中表达于细胞浆和细胞核，总阳性率分别为：33%，100%，80%，65%。AHR在三种皮肤肿瘤中表达显著高于正常皮肤（X²=9.41，P<0.01）；AHR在AK中的表达高于皮肤SCC（X²=4.57，P<0.05）；AHR在细胞核表达中阳性率分别为：20%，70%，60%，50%（图1），AHR在三种皮肤肿瘤细胞核表达阳性表达率显著高于正常皮肤（X²=6.15，P<0.05）。见表1。

2.2 CYP1A1在正常皮肤、AK、鲍温病和皮肤SCC中的表达测定结果：CYP1A1在正常皮肤、AK、鲍温病和皮肤SCC中表达于细胞浆，阳性率分别为20%，20%，20%，15%；CYP1A1在三种肿瘤表达的阳性率与正常皮肤无差异（X²=0.05，P>0.05）。见表1。

3讨论

AHR及下游信号通路与皮肤肿瘤的发病相关。研究显示环境污染物如PAHs，TCDD，苯并芘、二苯并咔唑（DBC）、煤焦油及香烟混合物等均是AHR强激活配体，它们在动物模型均可引发皮肤SCC。AHR作为皮肤环境污染物的受体在皮肤癌变的过程中发挥重要作用。AHR被激活后其下游细胞色素代谢酶（CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1等）随后被激活，环境污染物经过代谢后水溶性增加，在这过程中污染物的毒性可能增强，特别是芳香烃类的代谢物可以直接攻击DNA形成突变。AHR与日光性皮肤肿瘤发生也有相关性。Fritsche等发现UVB照射角质形成细胞后，细胞内的色氨酸产生的光产物6甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑（FICZ），FICZ能够激活AHR。AHR被UVB激活后能够抑制紫外线诱导的皮肤角质形成细胞的凋亡过程，在动物实验中证实，AHR敲除的小鼠相比正常小鼠，同样剂量的UVB长期照射后，皮肤SCC生成数量减少50%。但是AHR与临床皮肤肿瘤的相关性研究尚未见相关报道。

本研究收集了临床皮肤SCC皮损以及其两种早期病变进行了研究。AK与日晒相关，是老年人群中发病率最高的皮肤肿瘤，也是典型的癌前病变。由AK发展生成的皮肤SCC恶性程度较高，容易早期转移。鲍温病是原位鳞状细胞癌，转变为皮肤SCC的几率很高。AHR在AK组织和鲍温病中的阳性率高达100%和80%，处于高表达状态；AHR在这两种皮肤肿瘤细胞核表达中阳性率为70%和60%，显示AHR信号通路在这两种皮肤肿瘤中处于激活状态；AHR在AK组织中的表达高于皮肤SCC；这些结果提示AHR高表达和激活与皮肤SCC生成的起始事件相关。相关细胞学研究也表明，AHR的激活可以导致细胞膜FEGFR的异常激活，还与NF-κB信号通路的激活有关，提示了AHR参与皮肤细胞增殖和炎症等肿瘤发生的早期事件。

本研究显示AHR下游经典基因CYP1A1的阳性率在正常皮肤和三种皮肤肿瘤细胞之间未有明显差异，而AHR在三种皮肤肿瘤细胞核内的表达均明显高于正常皮肤，显示AHR处于激活状态。这提示，AHR在皮肤肿瘤细胞中被激活后没有启动经典的TCDD/AHR/ARNT/CYP1A1途径，而是启动了不依赖ARNT的蛋白磷酸化信号转导途径。其下游激活的靶位基因可能包括β-连环蛋白、原癌基因c-Myc、表皮生长因子受体等。这条信号通路下游可能与细胞增殖和分化、免疫调节等相关，需要进一步探讨，以期为皮肤肿瘤的发病研究带来新的突破。endprint