文昌鱼中一个2A肽介导的多基因表达载体构建

华俊豪,李 光,王义权

(厦门大学 生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361102)

多基因表达载体的优势在于可同时表达2个或多个基因,但早期常用的多基因表达载体多存在容量小,易出现上、下游基因表达失衡,蛋白活性低或所表达蛋白不能精确定位等缺陷[1],后来研究者在2个目的基因间插入一段内部核糖体进入位点(IRESs),用于表达2个非偶联的蛋白,成功克服了表达活性低及不能精确定位等问题;然而IRESs与核糖体结合的亲合力不易调控,对所表达的下游蛋白活性影响较大[2],这些因素限制了这一策略在构建多基因表达载体上的应用．近年来,一种具有自剪切功能、由2A肽(P2A)介导的多基因表达载体得到广泛应用,该策略避开了多基因表达时蛋白活性不高和下游基因表达量低等缺陷,是较为理想的多基因表达方法[3]．此方法通过P2A改变核糖体的活性,促进P2A的甘氨酸残基(Gly)与tRNA-Gly之间酯链的水解,从转录复合物上释放上游多肽的同时又推进下游多肽的翻译[4];此外,在目的基因上游或下游插入信号肽编码序列,可使所表达的目的蛋白定位到细胞核、叶绿体、线粒体、细胞膜或胞质微管等特定位置[5]．

文昌鱼(amphioxus)隶属于脊索动物门(Chordata)头索动物亚门(Cephalochordata),是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的一个重要过渡类群,也是现存脊索动物门中最古老的一个类群,在研究脊椎动物起源与演化方面有十分重要的作用[6]．文昌鱼有个体小、产卵量大、体外受精、体外发育、胚胎及成体都透明而便于观察等优点,随着实验室人工繁育成功[7]、诱导产卵技术完善[8]和胚胎显微注射技术建立[9]等一系列成果的取得,其作为模式动物应用的脚步正不断加快．然而现阶段以文昌鱼为材料的研究中,还不像其他模式动物那样已有各种商品化的分子工具可以直接应用,因此大大阻碍了文昌鱼作为模式动物的应用．

Kim等[10]通过pSYC-97质粒(pCS2转录系统)在HeLa细胞、斑马鱼(Daniorerio)胚胎、小鼠(Musmusculus)肝细胞中验证了P2A介导的eGFP和mCherry基因表达,且上、下游蛋白剪切效率极高．由于pCS2转录系统在文昌鱼中表达效率不高,为此本研究基于pXT7转录系统合成NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX的mRNA并注入文昌鱼胚胎,验证在受精后文昌鱼体内P2A介导表达的eGFP和mCherry蛋白剪切效果,进而构建由文昌鱼热激蛋白基因启动子(BbHsp70)启动的P2A介导的多基因表达载体,为文昌鱼未来的转基因研究和基因功能分析提供有效的分子工具．

1 材料与方法

1.1 材 料

实验中所用佛罗里达文昌鱼(Branchiostomafloridae)引种自游智凯博士实验室(Institute of Cellular and Organismic Biology,Taiwan,China),采用本实验室已建立的方法[7]饲养,按照已报道的方法[11]诱导产卵;实验中所用引物由厦门铂瑞生物科技有限公司合成;pSYC-97质粒由Kim博士(Chonnam National University Medical School,Republic of Korea)提供[10];pXT7和BbHsp70-pCAG载体为本实验室自存;Primer Star高保真DNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性内切酶KphⅠ和SpeⅠ购自TaKaRa公司;D2000 DNA分子质量标准购自天根生化科技(北京)有限公司;PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和质粒纯化试剂盒购自Omega公司;Trans5α感受态细胞购自TransGen公司;mMESSAGE mMACHINE T7 mRNA合成试剂盒购自Ambion公司;荧光染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Roche公司;RIPA裂解液购自碧云天公司;anti-eGFP多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司;羊抗鼠肌动蛋白(actin)单克隆抗体购自Proteintech公司;辣根过氧化物酶-增强型化学发光法(HRP-ECL)显色底物购自 Advansta公司．

1.2 质粒构建与mRNA合成

以含有目的片段NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX的质粒pSYC-97为DNA模板,按目的片段上、下游序列设计引物eGFP-P2A-mCherry-F1(5′-GGGGTACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGT-3′)和eGFP-P2A-mCherry-R1(5′-GGACTAGTTCAGGAGAGCACACACTTGCA-3′),引物设计时分别在5′-端与3′-端引入KphⅠ和SpeⅠ黏性末端酶切位点(下划线),用Primer Star高保真DNA聚合酶扩增目的片段．PCR产物经酶切后连接到pXT7载体上,转化Trans5α感受态细胞,菌落PCR筛选阳性克隆,测序验证,获得重组的eGFP-P2A-mCherry-pXT7质粒．类似地,将NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX与本实验室已有的BbHsp70-pCAG载体重组,获得BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG质粒．

用SmaⅠ线性化eGFP-P2A-mCherry-pXT7质粒,再用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒体外转录合成mRNA,1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳定量后分装,置于-80 ℃冰箱中备用．

1.3 显微注射与胚胎培养

显微注射参照Liu等[8]的方法：用200 μL移液枪将文昌鱼未受精卵细胞均匀铺在涂抹多聚赖氨酸的载玻片上使其成2～3条平行直线,将NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA(约300 ng/μL)和丙三醇按7∶3(体积比)混合后灌入注射器中,灌针完毕后用金属片开针使其达到注射要求．注射气泵充气完毕后(注射压强350～450 hPa),通过操作柄将注射针调至卵细胞赤道面下方7～8 μm进行显微注射(注射时间为0.1～0.2 s)．注射结束后立即向培养皿中滴加5～10 μL精液受精,同时在另一培养皿中对同一雌性个体所产的卵细胞用同样的方法受精作为对照[8]．体视显微镜(SZX7型,Olympus公司)下观察到受精膜举起后即刻更换新鲜海水,以彻底去除过量的精液和溶解在海水中的多聚赖氨酸,同时清除显微注射时损坏的卵,然后将受精卵置于25 ℃湿度饱和的培养箱中培养．在胚胎发育期间,荧光体视显微镜(SZX10型,Olympus公司)下观察胚胎发光情况．

注射BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG质粒(约340 ng/μL)的方法同上,注射组和对照组的卵细胞在同样的条件下受精、培养,胚胎发育至原肠胚早期时35 ℃热激0.5 h,以诱导BbHsp70启动下游基因表达[12],然后在胚胎发育不同时期,荧光体视显微镜下观察胚胎发光情况．

1.4 激光共聚焦显微观察

选取有荧光蛋白表达的胚胎在4%(质量分数)多聚甲醛-吗啉丙磺酸溶液(PFA-MOPS,pH=7.4)中室温固定0.5 h后,转至丙三醇中终止固定；观察前将胚胎用含0.1%(体积分数)吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST,pH=7.4)洗净,再用1 μg/mL DAPI染液进行细胞核染色15 min以勾勒胚胎轮廓；然后于80%(体积分数)丙三醇中,激光共聚焦显微镜(LSM780型,Zeiss公司)观察、拍照,其中观察eGFP的波长为488 nm,观察mCherry的波长为543 nm,观察DAPI的波长为358 nm．

1.5 蛋白质免疫印迹(Western blot)实验

分别收集注射组和对照组的8体节时期神经胚各200枚,经RIPA(radio immunopreciptation assay)裂解液裂解,12 000 r/min离心取上清,获得可溶性总蛋白；BCA(bicinchoninic acid)法测定蛋白浓度,取50 ng总蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至硝酸纤维素膜,5%(质量分数)脱脂牛奶封闭；一抗杂交(anti-eGFP按1∶1 000稀释),洗膜,二抗杂交(羊抗鼠actin按1∶5 000稀释),洗膜,加HRP-ECL显色底物,暗室内显色．

2 结果与分析

2.1 目的片段PCR扩增与质粒构建

以pSYC-97质粒为模板,扩增NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX目的片段,大小为1 665 bp,1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物符合预期大小,无杂带(图1)．

(a)原肠胚中期；(b)神经板时期；(c)5体节时期.图中标尺均为100 μm.图2 NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA注射后在文昌鱼胚胎中的表达 Fig.2NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA expression in amphioxus embryos after injection

目的片段经双酶切后连入pXT7载体中,转化感受态细胞后取阳性单克隆测序,结果证实目的片段正确插入pXT7载体中．用同样的方法构建BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG重组表达载体并经测序验证.2个重组质粒图谱见附录图S1(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20180107.html)．

2.2 外源mRNA在文昌鱼胚胎内翻译表达eGFP和mCherry蛋白

将由体外转录所得的NLS-eGFP-P2A-mCherry-

M.D2000 DNA分子质量标准;NC.阴性对照;F.目的片段．图1 PCR扩增NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX目的片段 Fig.1PCR amplification of NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX

CAAX mRNA注入文昌鱼未受精卵细胞,受精后于培养箱中培养,至胚胎发育不同时期,荧光体视显微镜下选取有荧光的原肠胚中期、神经板时期和5体节时期的胚胎,于激光共聚焦显微镜下观察拍照,结果如图2所示．当胚胎发育至原肠胚中期时即可观察到eGFP发出的绿色荧光和mCherry发出的红色荧光,此时2种荧光均较微弱,随着胚胎发育时间的推移,2种荧光的亮度都不断增加;而未注射的对照组中只能观察到极其微弱的绿色荧光,这是文昌鱼自身发出的本底荧光[12],对外源GFP发出的绿色荧光观察影响不大．

2.3 重组eGFP和mCherry蛋白在胚胎中的定位

如图3所示:当注射NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA的文昌鱼胚胎发育至神经板时期时,可见较强的绿色和红色荧光(图3(a)),表明外源mRNA已翻译所编码的蛋白,但此时这2种荧光在细胞中均主要分布在细胞质内，没有明显差异;当胚胎发育至5体节时期时,可以观察到绿色荧光主要集中到细胞核内,而红色荧光则主要集中到细胞膜上(图3(b)),说明该时期的胚胎中重组eGFP和mCherry蛋白已被剪切开,在各自连接的信号肽作用下分别定位到细胞核内和细胞膜上．

(a)神经板时期;(b)5体节时期.图中标尺均为20 μm．图3 重组eGFP和mCherry蛋白 在文昌鱼胚胎细胞中的分布 Fig.3Distribution of recombinant eGFP and mCherry proteins in amphioxus embryonic cells

2.4 文昌鱼胚胎中P2A介导的2种荧光蛋白剪切效率

(a)GFP;(b)actin.M.蛋白质分子质量标准.图4 文昌鱼胚胎8体节时期P2A剪切效率 Fig.4The efficiency of P2A cleavage in the 8-somite-stage embryos

鉴于胚胎在5体节时期即可观察到上、下游蛋白被剪切开的现象,为进一步检测P2A介导的上、下游蛋白在文昌鱼胚胎中的剪切效率,收集了mRNA注射组和对照组8体节时期的胚胎各200枚,提取总蛋白后用Western blot方法检测胚胎中eGFP和mCherry蛋白的剪切效率,结果如图4所示:在注射组35 ku处有已剪切的eGFP,70 ku处有少量未剪切的eGFP；45 ku处条带为文昌鱼内源GFP蛋白[12],相对于外源的eGFP少很多．经Image J软件分析比较条带灰度值,P2A剪切效率达到91%,略小于其在斑马鱼中100%的剪切效率[10]．

2.5 BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG在文昌鱼胚胎中的表达

检测BbHsp70与P2A结合构建的表达载体BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG在文昌鱼胚胎中的表达效果,结果如图5所示：当胚胎发育至神经板时期,BbHsp70即可很好地启动下游P2A连接的融合蛋白表达;待胚胎发育至5体节时期,eGFP和mCherry蛋白已分别定位到细胞核内和细胞膜上．

3 讨 论

头索动物文昌鱼是研究脊椎动物起源进化和发育的一种重要模式动物．虽然文昌鱼的分子生物学研究中已有胚胎显微注射技术[9]、BbHsp70介导的过表达技术[13]、Talen介导的基因敲除技术[14]及Tol2转座酶系统介导的基因敲入技术[15],但分子生物学研究的技术手段依然缺乏,从而大大阻碍了文昌鱼作为模式动物的应用．

(a)神经板时期，标尺为100 μm；(b)5体节时期，标尺为100 μm；(c)5体节时期，标尺为50 μm.图5 共聚焦显微镜观察BbHsp70启动的下游荧光蛋白表达 Fig.5Observation of the fluorescent protein expression initiated by BbHsp70 under a confocal microscope

在转基因动物的构建过程中,为方便目标基因的检测,常需要以GFP、RFP和YFP等示踪荧光蛋白与目标基因所编码的蛋白同时表达,这就依赖于一个介导多基因同时表达的载体．目前构建多顺反子载体的方法主要包括:构建多启动子(multiple promoters)表达载体、构建剪切(splicing)载体、表达融合基因(fusion gene)以及基因之间以IRESs或自剪切P2A连接等[16]．其中P2A具有序列短,高裂解活性,上、下游基因表达量相同的优点[3];并且已经证实如果需要3个以上基因同时表达时,可以选择不同属的P2A打破序列同源性以协助维持外源基因插入的稳定性[17]．

在将前人报道的P2A介导的多基因表达载体[10]引入文昌鱼转基因实验研究时,发现该载体在文昌鱼中的工作效率极低,故本研究用该系统中的P2A与本实验室此前已构建的BbHsp70-pCAG载体重组,重构了一个由源于文昌鱼热激启动子启动的新载体BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG．结果显示：由P2A连接的上、下游蛋白在文昌鱼体内的剪切效率达到91%,并可分别定位于细胞核内和细胞膜上;此外，通过热诱导方式启动基因表达,不但表达效率高,而且可实现在特定时间启动基因表达．由此,本研究成功构建了一个P2A介导的多基因表达载体,为文昌鱼研究提供了一种高效、可控并能同时平衡表达2个蛋白的应用体系．

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