利用多重PCR技术构建与PRDC相关的4种病毒病的快速检测方法

李世震，盛金良

（新疆石河子市一四二团兽医站，新疆 石河子 832029）

现代养猪业的快速发展，由于集约化程度及环境等多重条件的影响，给养殖户带来的不只是经济利益的提高，同时也大大提高了疾病的发生几率，尤其是大大提高了多种病混合感染的发病几率。猪呼吸道疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）就是一种由病毒、细菌、环境应激和猪体免疫力低下相互作用造成的一种多种因素多种病原混合感染的呼吸道疾病综合征。通常由病毒或者霉形体首先侵袭住的呼吸道，破坏呼吸道的防御屏障，然后各种气源性病菌就很容易进入呼吸道和肺部，造成继发性混合感染。

造成猪呼吸道疾病综合征的原发性病原主要为猪瘟病毒（classicalswinefever virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproduetive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）、猪伪狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）等。这4种病毒病常常呈现混合感染，且可以不同程度的损伤免疫系统，降低机体免疫了，从而加剧混合感染与发病程度。

依照兽医实验室“科学，公正，准确，高效”的诊断质量方针，为了能够快速、准确的从根源上进行疫病防控，迫切的需要一种能够一次性检测多种病原的检测方法。多重PCR技术就是在传统PCR技术的基础上，在一个反应体系中使用2对及以上的引物，对不同病原进行扩增，这种方法与传统PCR技术相比，不仅大大减少了多种病原检测的试验步骤，而且还保留了PCR技术的特异性与敏感性。

1 材料与方法

1.1 病料及相关试剂

试验所使用的95份病料来自于新疆石河子市部分地区的10个规模化猪场。TRIzol试剂购自于Invitrogen公司，Multiplex PCR MasterMix购自上海研谨生物科技有限公司、DNA Maeker I购自北京天根生物工程技术服务有限公司、快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；CSFV、PRRSV、PCV2、PRV扩增所使用的模板均由石河子大学动物科技学院基础兽医学实验室提供；琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2 引物设计与合成

本实验为建立引起PRDC的4种病原的快速检测方法，因此根据PCR反应原理，每一种病原需要上下游引物各一条，共需要设计4对特异性引物。根据相关参考文献设计特异性引物及序列如表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 目的片段扩增所使用的引物

1.3 样品DNA和总RNA的提取

95份病料样品RNA提取步骤参照TRIzol说明书进行即可，组织DNA提取按照DNA提取试剂盒说明书进行，提取出来的DNA保存在-20℃，RNA保存问无为-80℃。

1.4 PCR反应条件的选择

根据4种病原的单重PCR条件， CSFV，PRRSV、PCV2、PRV的多重PCR选用50ul反应体系：Multiplex PCR MasterMix 25ul，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV上下游引物（20umol/L）各1ul，4种模板各2ul，ddH2O补至50ul。

反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

使用3.0%琼脂糖进行凝胶电泳，在多重PCR的反应体系里可以扩增出来622bp、490bp、424bp、298bp4条可以清晰分辨的条带，与单重PCR相比，条带大小一致。

2 结果分析

使用建立的多重PCR方法对95份病料样品进行单重PCR与多重PCR扩增对比，通过对比，两种方法的符合率达到100%。

3 讨论

随着生猪规模化、现代化、集约化养殖方式的转变，多种病原混合感染的现象越来越普遍，猪群疾病的发生与流行对养猪业的危害也越来越大，直接制约着生猪养殖的发展，影响经济发展。PRDC的这4种病原又是新疆地区规模化猪场普遍存在的，往往发生混合感染、继发感染等，而且单凭临床症状很难对这几种病做出准确的诊断，传统的诊断方法，存在操作复杂，过程繁琐，费时费力等多种因素，因此，构建一种快速的诊断方法对疫病的诊断和流行病学调查都有极大的好处。利用多重PCR技术构建的快速检测方法，不仅保持了普通PCR技术的灵敏性和特异性，还能够同时检测4种病原，是一种快速、简单、有效的实验室诊断检测技术。

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