仿生微流控肝芯片研究进展

厉海笛 陈晓萍

(浙江工业大学生物工程学院，杭州 310000)

肝脏是机体的代谢中枢，它合成血浆蛋白、调节糖原储存、生成激素，也是药物代谢和解毒的主要场所。肝脏毒性是化合物和药物常见的毒性反映，是临床前评估的一个重要指标。传统上，临床前评估通过动物实验进行检测，但是其昂贵的费用、耗时耗力、与人体反应对应性低以及动物福利等伦理方面的问题，使得寻求新型高效的体外评价方法成为一个重要的发展趋势[1]。

仿生微流控器官芯片是2011年以来快速发展的一个新兴研究领域，通过在微型芯片上建立模仿人体器官的微组织，并加入高通量检测功能，从而使其成为一种高效、节约、仿生的生理毒理学研究与药物研发工具[2]。在肝芯片方面，近年也开展了大量的研究工作，并取得了一系列重要成果。

1 仿生微流控肝芯片的设计理念

仿生微流控芯片集仿生、小巧、高效于一体。在肝芯片的设计中，芯片的尺寸大小仅有几厘米，通过微加工工具制造出精细的微通道网，驱动微量培养液在其中流动，精准地模拟着体内肝组织微环境，充分体现出细胞与细胞之间、细胞与生长因子之间的相互作用，从而仿制出类似于体内肝脏器官的功能[3]。

为了更好地建立能模拟肝脏组织并能产生类似体内肝功能的生理学模型，研究人员还将三维肝细胞培养技术应用到了微流控芯片中。人体内的肝脏按照特定的组织结构整齐排列，在普通培养中肝细胞无法达到这种效果，因此采用了三维培养的方法来控制细胞的空间排列，以产生类似于天然肝脏的结构与功能[4]。例如，Chao等用HepG2细胞和人主动脉内皮细胞，制造出类似于肝小叶3D结构的微组织，它能够代谢对乙酰氨基酚、异烟肼和利福平，并能够通过荧光素二乙酸酯或者碘化丙啶染色对肝毒性进行评估[5]。Yum等将肝脏隔室与含有其他组织类型的细胞隔室相互连接，用以研究肝细胞如何影响其他类型的细胞[6]。

除此之外，一些肝芯片还开发了高通量快速监测系统，以便快速评价药物和化合物的药效和毒性。例如，Riahi等在芯片中加入了一种高灵敏的微流控电化学免疫传感器，能够对芯片细胞产生的生物标志物进行在线检测，从而为肝毒性的长期体外评估和实时监测提供了一个新的平台[7]。

2 肝芯片的微通道灌流

肝芯片中的组织细胞是由微通道中灌流的培养液来滋养的，根据驱动这种灌流的动力来源来划分，主要有蠕动泵驱动、重力驱动和纸基虹吸法3种方法。

2.1 蠕动泵驱动的微通道灌流

微流控芯片外接蠕动泵驱动微通道灌流是目前最常用的灌流方法，它具有成本低、小型化、通用、准确和处理生物样品灵活等优点。蠕动泵驱动的微通道灌流能为微尺寸室中的活细胞提供可控的培养微环境，用于模拟组织和器官的生理功能[8]。He等将肝脏的天然血管脉路复制于PDMS模上，构建出微血管通道网络，然后将包裹了HepG2人肝癌细胞的琼脂糖水凝胶导入芯片微通道中，用外接蠕动泵连续灌注形成单向流，以形成肝小叶样结构，这种芯片模拟体内血液真实的流动途径，能更好地体现肝脏作为代谢器官的机能[9]。Zhou等将生物传感器与微通道灌流的肝细胞和星形细胞相连接，能动态监测乙醇损伤引起的肝星形细胞分泌TGF-β信号[10]。

2.2 重力驱动的微通道灌流

Lee等对微流控系统的驱动系统进行改造，不使用外接蠕动泵，而是通过重力驱动将细胞灌注于芯片的微通道中。该通道具有类似于肝脏内皮层窗口的通孔，可以使相邻通道中的肝脏聚集体互相进行营养交换，其优点是芯片上的入口和出口储存器能够含有不同体积的培养基，并且由于不需要外部泵，简化了芯片的装置系统[11]。Messner等利用重力灌流进行3D微组织肝球体培养，该芯片能够使肝细胞功能稳定保持5周以上，可用于对乙酰氨基酚和双氯芬酸等化合物进行长期的毒性评估[12]。Esch等在芯片上种植带有微通道的3D肝细胞团，再将芯片置于摇摆平台，通过±12°角的摇摆运动，驱动微通道中液体流动[13]。Ong等研发的无泵微流体3D灌注平台中，采用微柱阵列培养肝细胞，在培养室两侧分别设置入口贮存器和出口贮存器，通过控制入口贮存器和出口贮存器的高度差来实现培养液持续的静水压力驱动流动[14]。这类重力驱动的微流控芯片不需要外部附加的蠕动泵驱动装置，因而制备成本较低。

2.3 纸基虹吸法的微通道灌流

纸基微流控芯片是2013年开始发展的又一种新型微流控分析方法，它以纸作为芯片基质，样品和培养液在毛细管虹吸力的驱动下自主流动，不需要辅助性驱动系统，具有易加工、低成本、易携带、操作方便等优点。例如，Vella等研制了一种基于纸基的微流控肝芯片，由塑料薄膜顶层、华氏1号层析纸制成的过滤层、雕刻有微通道的蜡膜疏水层和塑料薄膜底层4层结构组成，可用于测定血清碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和总血清蛋白[15]。NR等则在纸基芯片上制备了图案化的疏水屏障和切割形成的亲水性纸通道，通过这些通道，微量样品和培养液被引导至特定的检测区，在纸基板上自主分离和滤过，从而快速、半定量地监测样本中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量[16]。然而，纸基芯片存在着一大缺点，就是仅能进行简单指标的测定，不适用于复杂和多步骤的检测。

比较上述3种灌流方式，由蠕动泵驱动的微通道灌流可以精确控制培养液的流动速度，为肝芯片培养室中的细胞提供可控的组织微环境，也减少了细胞受到的剪切力伤害，其主要缺点是需要连接复杂的设备，成本高，占据空间面积大；重力驱动的微通道灌流不需要复杂的外部连接装置，芯片的培养和后续观察比较方便，但是培养液的流速不够稳定，容易出现细胞脱落、细胞损伤等异常情况；纸基虹吸法微通道灌流发展时间最短，它利用毛细管虹吸力驱动引起介质流动，只需要微量培养液即可进行检测，成本低，操作简单方便，缺点是只适用于进行简单的检测。目前，蠕动泵驱动的微通道灌流仍是主要的微流控肝芯片作用模式，而重力驱动的微通道灌流正在快速发展和提高之中。

3 肝芯片的细胞体系

肝脏是复杂的组织器官，由多种组织细胞构建形成，目前研制的仿生类肝芯片只能模拟其中的部分机能，单细胞微团、多细胞共培养体系、多器官集合体系分别模拟了单种肝细胞、条索状肝组织结构、肝与其他器官集合体的代谢机能。

3.1 单细胞微团

在微流控芯片中，最常采用的细胞体系是单细胞微团，即只用一种组织细胞构建细胞微球体。例如，在哈佛大学wyss研究所研发的仿生微流控肝芯片中，采用光交联明胶甲基丙烯酰基水凝胶包裹HepG2细胞或C3A细胞制成球状体，再用生物打印机将这种球状体排布于微流控芯片上，通过检测特异性标志物的变化评估肝的毒性。在这种体系中，球状体能够存活30天以上，适合于进行长期毒性的评价。同时，15mM对乙酰氨基酚的毒性测试结果表明，其研究数据与大鼠在体实验中的研究结果相近[17]。在另一项研究中，Tong等首先制备肝细胞微球，再将这些微球用聚乙二醇(PEG)和半乳糖进行表面修饰改性，最后将修饰后的肝细胞微球交联于盖玻片或包被于多孔薄膜进行固定；在微流体灌流时，这种固定化的肝细胞微球体系由于不易流失细胞而质量稳定[18]。单细胞微团体系构建简单，便于快速和准确地开展单种细胞机能特性和药物效应的检测，但其球状体形态不利于内部细胞的营养物质交换，也不适用于研究细胞间的相互作用。

3.2 多细胞共培养体系

为了体现器官中细胞间复杂的相互联系，研究人员开发了多细胞共培养体系，将肝细胞与其他支持细胞按一定比例共培养，从而重现体内肝脏组织中复杂的细胞间联系，也有利于维持肝细胞的活力与功能。Liu 等将大鼠肝细胞、NIH-3T3鼠胚胎成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞共培养，形成了能够分泌白蛋白和尿素的类肝球状体，其分泌CYP450的能力能保持15天，可用于预测药物清除率和药物介导的CYP450活性调节[19]。Yip等使用悬滴法，将肝癌细胞与成纤维细胞混合均匀，然后包裹于胶原水凝胶中进行共培养，在抗癌药物的药效测试中，这种肝癌-基质细胞共培养体系比单纯的肝癌细胞体系呈现更强的耐药性[20]。Ma等用HepG2细胞和主动脉内皮细胞，共培养制造出3D肝小叶样微组织芯片，它可以模拟肝脏中通过内皮细胞共同代谢所产生的肝毒性[21]。杨兴元等采用微纳加工技术，制备三维微图案化芯片基板，在芯片上实现了间充质干细胞与肝癌细胞的非接触共培养和细胞图案化生长，用于研究干细胞的归巢效应[22]。Grix等采用立体平版印刷术结合生物打印方法，将肝细胞和星状细胞打印到带有中空微流体通道的水凝胶中，培养液经通道系统灌流滋养组织细胞，这种类肝芯片很好地模拟了肝脏组织静态条件下的机能特性[23]。通过多细胞共培养体系建立肝细胞与非实质细胞共存的生长体系，有利于类肝组织的结构机能稳定，但这种微体系的构建具有很高的技术要求。

3.3 多器官集合体系

机体是一个整体，完整动物的药物代谢和毒性作用是多个器官共同作用的结果，多器官集合体系将肝脏模型与其他器官或组织的模型相结合，形成多种器官组织细胞的共培养，以探究各个器官之间的相互联系。2015年起，研究人员更是将多种器官模型装载在同一个微小的芯片上，制造出能评估多器官毒性的多层芯片。Maschmeyer等制备了模拟肠、皮肤、肝和肾4种器官的集合芯片，评估化合物经肠道吸收、肝脏代谢、肾脏和皮肤排泄的体内转化过程[24]。Oleaga等将心脏、肌肉、神经元和肝脏结合在一起，并将此芯片用于研究多柔比星、阿托伐他汀、丙戊酸、对乙酰氨基酚和N-乙酰基间氨基苯酚的毒性作用[25]。秦建华等构建了一种多器官集合芯片，将代表肝、肿瘤组织(乳腺癌和肺癌)和正常组织(胃细胞)的4种细胞系分别培养于多层分隔小室，通过微通道交联模拟整体中的药物代谢和靶细胞特异毒性[26]。Satoh等则构建了一种多通道、多器官组合芯片系统，采用气动压力驱动介质循环，可开展多种器官的平行实验，如抗癌前体药物卡培他滨对小肠、肝脏、肿瘤组织和结缔组织的作用[27]。多器官集合芯片技术在微型芯片上构建模拟多组织器官的仿生人体，能够更好地检测肝药物的体内代谢情况，深入研究药物的生理生化机制与毒性药效作用，缩短药物经细胞-动物-人体试验的研发周期，大大降低研发成本。

从单细胞微团、多细胞共培养体系到多器官集合体系，仿生微流控肝芯片采用了越来越复杂的细胞结构体系，其目标是充分模拟体内的肝脏结构与机能。但仿生微流控肝芯片的研究近几年才刚刚开展，关于肝脏结构与机能的模拟目前还处于初步阶段。

4 仿生微流控肝芯片的应用

仿生微流控肝芯片的快速发展是由于其重要的应用前景，通过模拟肝脏的组织结构与机能，这种技术可用于快速灵敏地进行肝脏生理机制研究、药理毒理评价、肝脏代谢过程的动态监测。

4.1 生理机制研究

仿生微流控肝芯片可用于研究肝脏的生理机制。例如，Prodanov 等研制了一种由多孔膜分隔的两个微流体室组成的微流控肝芯片，由其模拟了肝窦的微结构与机能[28]。Mi等使用天然可降解的鼠尾胶原(Collagen-I)和生长因子，培养HepG2和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，在芯片上成功构建了肝窦样结构，其HepG2肝板和可控且均匀分布的EC单层结构很好地模拟了体内肝脏的形态结构和机能[29]。Choe等研制了一种能够重现药物首过代谢的微流体肠肝芯片，该芯片由肠上皮细胞(Caco-2)和肝细胞(HepG2)两个单元组成，单元间以多孔膜分割形成多细胞共培养，这种设计体现了药物先通过肠腔吸收、再经多孔膜传输到肝脏中代谢的体内过程[30]。Mandy等在微型芯片体系上建立了胃肠道-肝脏-其他组织的联合系统，研究纳米颗粒的口服吸收，结果证明：这种体外芯片模型与人体高度相关，并能较准确地评估纳米粒子与人体组织的相互作用[31]。Snouber等建立了一种肝-肾联合芯片，用HepG2/C3a或HepaRG细胞系模拟肝脏，用MDCK细胞系模拟肾脏；该芯片用于研究肝-肾间的联合作用，如化合物经肝代谢后的肾内效应[32]。Materne等构建了由HepaRG和肝星状细胞共球体模拟的肝组织，已分化的NT2神经细胞球状体模拟神经组织，其组成的肝-脑复合芯片用于研究化合物经肝代谢后对神经组织的效应[33]。Bauer等把胰岛微组织与肝脏球体以1∶4的配比，在芯片上建立了器官串扰模型，并通过测量胰岛微组织释放到培养基中的累积胰岛素来评估肝和胰岛的功能性偶联，结果证明这两个器官共同参与了葡萄糖体内平衡[34]。

4.2 药理毒理学研究

仿生微流控肝芯片在药物毒性评价和毒理学测试方面也有重要应用。例如，Esch 等将Caco-2和HT29-MTX细胞模拟的肠道隔室与HepG2/C3a细胞模拟的肝脏隔室集合为肠-肝复合芯片，用于研究纳米药物经肠道吸收后对肝脏的毒性作用[31]。Vernetti等构建了一个连续灌流的模拟肝索芯片，其中依次排布了衍生的肝细胞PHHs、星状细胞LX-2、内皮细胞EA.hy926和单核细胞U937，这种肝芯片可用于曲格列酮、尼美舒利等药物毒性的连续检测[35]。Skardal等将与UV-可交联水凝胶溶液混合的肝细胞引入密封的微流控通道中，经光图案化形成特定的类肝结构，在7天内采用循环介质流维持其功能，可用于监测乙醇损伤造成的尿素和白蛋白分泌减少，以及细胞损伤标记增加[36]。林金明等研制了肠-肝-胶质母细胞瘤仿生系统来评估胶质母细胞瘤药物的药效，在芯片上层用中空纤维培养Caco-2细胞来模拟肠道，在芯片底部用两个小室分别培养HepG2细胞和胶质母细胞瘤细胞来模拟肝脏和胶质母细胞瘤，这个系统可用于研究药物经肠道吸收和肝脏代谢后对胶质母细胞瘤细胞的诱导凋亡作用[37]。秦建华等开发了一种新的肝肾联合芯片，具有上下两个聚二甲基硅氧烷层(PDMS)，分别培养肝细胞和肾细胞，中间以多孔膜构成微通道分隔，肝细胞和肾细胞的代谢产物可通过多孔膜进行物质交换，这种芯片可以有效评估药物经肝代谢后引起的肾毒性[38]。

4.3 代谢监控和评估

在仿生微流控肝芯片中，加入快速灵敏的检测系统，可以用于高通量实时监测。Shin等研制了一种新型肝芯片，将特制的电化学生物传感器连接于芯片微流控系统，能实时检测芯片细胞所产生的可溶性生物标记物，从而连续7天在线监测药物在肝脏的代谢活性[39]。Bavli等在肝芯片中嵌入磷酸化荧光微探针监测线粒体呼吸作用，用电化学传感器检测代谢物葡萄糖和乳酸，对肝毒害时的线粒体损伤进行实时在线的评估[40]。Rennert等构建了交联有内皮细胞和单核细胞的复合肝芯片，在芯片微通道的出入口嵌入氧发光传感器，对细胞中的氧消耗水平进行实时监测，以此评价肝组织的代谢状况[41]。近年来，多种物理、生物化学和光学传感器已被纳入肝脏芯片平台，用于细胞行为的自动化和持续性监测，以实时监测培养过程中肝细胞或肝细胞球体的形态和功能。将生物传感器与微流控芯片技术相结合，可以到达高通量药物检测的目标，提高药物毒性评价和毒理学测试方面的检测效率。

5 展望

仿生微流控器官芯片是基于组织工程、生物材料和微流体力学前沿技术发展起来的一个新兴领域，它具有方便、灵敏、快速、高通量等优点，在药效和毒性评价中具有重要的应用前景[42]。目前，仿生微流控肝芯片尚处于研究的起始阶段，在进入实际应用前还有许多关键性的技术问题需要解决。

1)如何在芯片中达到与生理相关的细胞密度，从而构建出体内器官的结构与机能，是有待解决的核心问题。这涉及复杂的多细胞联系，而且在体外实现细胞的三维立体生长也是一大难题。可能的解决方案是：采用原代肝细胞或干细胞诱生的肝细胞作为优质细胞来源，以最大限度地维持细胞的体内生理特性；采用组织支架建立细胞的三维培养也是一个很有潜力的发展方向，目前常用海藻酸盐、胶原、明胶甲基丙烯酰基(GelMA)和聚乙二醇(PEG)等生物大分子作为构建支架的材料。

2)如何实现芯片质量的稳定性和可重复性，是另一个重要的问题[43-45]。这方面目前主要的关注点有：一是改进芯片基板的制备材料，如将具有自发荧光的PDMS更改为玻璃等其他透明材料；二是加强细胞培养中的无菌管理，如研制全封闭无泵芯片；三是改善芯片的保存和运输技术，如创建低温储存肝芯片。

随着研究工作的不断进展，仿生微流控器官芯片技术将越来越趋向成熟，有可能作为动物实验体外替代模型，在化合物药效和毒理评价中得到实际应用。