三阳清解液乙状结肠滴注对内毒素诱导发热模型大鼠体温及血清IL-6、MIP-1含量的影响

王晓燕 汤瑞莲 刘宝琴 韩升波 王慧明 李小艳 何洁鑫 李 晶

（1.河南省郑州市中医院，河南 郑州 450007；2.河南中医药大学，河南 郑州 450008）

小儿外感发热是儿科常见病、多发病，全年均可发病，治疗失当可诱发惊厥的发生，或转为肺炎、心肌炎等，给患儿带来极大的痛苦，也给家长带来极大困扰，故研发治疗此病的药物及给药途径非常必要。三阳清解液由笔者依据张仲景《伤寒论》六经辨证理论，结合现代医学研究，总结二十多年临床经验，参阅大量医学文献，多方筛选，精心设计，在《伤寒六书》柴葛解肌汤、《伤寒杂病论》的大柴胡汤、白虎汤基础上衍化而来。笔者用三阳清解煎剂直肠滴注治疗小儿外感发热 （风热夹滞型）取得了较好的临疗效，具有起效快、疗效好、体温不易返弹、伴随症状缓解明显、不良反应小等特点［1］。本实验采用腹腔注射脂多糖（LPS）制作大鼠发热模型，并观察三阳清解液乙状结肠滴注对发热模型大鼠体温及血清中致热性细胞因子的影响，旨在探讨三阳清解液的退热作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g；购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：11400700164869。

1.2 试药与仪器 脂多糖（LPS）（100mg），批号530F032，购自索莱宝科技有限公司；大鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（96T）、巨噬细胞炎症蛋白-1（MIP-1）ELISA 试剂盒（96T），批号：20150807A，深圳子科生物科技有限公司。三阳清解液低剂量组：葛根5 g，柴胡8 g，黄芩 6 g，生石膏 20 g，生栀子 8 g，莪术 5 g，生大黄4 g，甘草3 g。以上为1剂量，水煎、过滤和浓缩，制备浓缩成生药质量60 g/mL的水煎液，装瓶备用，根据实验需要调制所需浓度。三阳清解液中剂量组生药质量浓度为120 g/mL；三阳清解液高剂量组生药质量浓度为180 g/mL；由郑州市中医院制剂室提供。泰诺林混悬液（对乙酰氨基酚口服混悬液），规格：3.2 g/100 mL，批号：160123070，上海强生制药有限公司生产。HW-1000超级恒温水浴，成都泰盟软件有限公司生产；TDL80-2B离心机，上海安亭科学仪器厂生产；BT100-2J蠕动泵驱动器，保定兰格恒流泵有限公司生产；IVC-Ⅱ型独立送风隔离笼具，苏州冯氏实验动物设备有限公司生产；MC-347欧姆龙电子体温计，大连欧姆龙有限公司生产；Spectra Max190型酶标仪（美国热电）。

1.3 动物分组及模型制备 实验前，每日上下午定时（上午8∶30，下午4∶30开始）对大鼠进行适应性测量口腔温度1次，连续2 d，取两次体温的平均值记为基础体温（T0）。测量时保持时间、地点、环境条件的一致性，测量探头从大鼠口角插入口腔舌下并保证每次定位角度一致，动作轻柔防止体温应激性增高。体温超过正常范围或相邻两次体温差值大于0.5℃的大鼠剔除。选用基础体温合格的大鼠48只，随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、三阳清解液高剂量组、三阳清解液中剂量组、三阳清解液低剂量组，每组8只，雌雄各半。

1.4 给药方法 给药前12 h各组大鼠禁食不禁水，以减少粪便对药物的干扰。实验前30 min打开恒温循环水浴，使循环水温恒定在37℃，用于加热乙状结肠滴注的受试药物，调整好恒速蠕动泵速度，三阳清解液各剂量组分别将配置好的受试药物加入到麦氏恒温水浴槽内温浴至37℃，恒温浴槽药物出口连接12号导尿管，通过蠕动泵将药物匀速滴注至乙状结肠。三阳清解液低、中、高剂量组生药质量浓度分别为60、120、180 g/mL,给药量按30 mL/kg体质量计算，约以20滴/min的速度乙状结肠滴注给药。空白组：腹腔注射生理盐水1 mL/kg体质量。模型组：腹腔注射生理盐水；阳性对照组：对乙酰氨基酚口服混悬液，按4 mL/kg体质量灌胃给药。

1.5 模型制备 致热源制备：无菌条件下，用0.9%氯化钠溶液将脂多糖（LPS）配成20 mg/L注射液，备用。乙状结肠滴注给药后立即造模：空白组腹腔注射0.9%氯化钠注射液1 mL/kg，其余各组大鼠分别腹腔注射LPS（20 μg/kg，1 mL/kg）建立大鼠发热模型。

1.6 观察指标 各组动物从造模0.5 h开始测体温（Ti），以后每隔1 h测1次体温，连续监测6.5 h。计算△T（△T=Ti-T0）。测量体温的同时，观察大鼠皮肤、毛色、肢体、精神状况、饮食、饮水、大小便、呼吸、体温、体质量的变化情况。

1.7 标本采集与检测 各组大鼠于给药后6.5 h将大鼠麻醉后，采用腹主动脉采血5 mL留取血标本，然后以3000 r/min，离心15 min，分离血清，置于-80℃冰箱冷冻，待ELISA检测IL-6、MIP-1用。

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组样本间差异用单因素方差分析，两两比较用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠给药6.5 h内体温变化趋势 见表1。结果示，腹腔注射 LPS（20 μg/kg）后，模型大鼠体温较空白组显著升高（P＜0.01），最高时（5.5 h）升温值达到1.37℃。三阳清解液各剂量组在给药及造模后0.5 h可见体温下降。三阳清解液各剂量组与模型组相比温度降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），且退热效果存在一定的剂量依赖关系，三阳清解液高剂量组退热效果优于中剂量组和低剂量组。实验过程中观察到部分发热模型大鼠出现竖毛、寒颤、精神萎靡的症状，部分大鼠甚至伴有轻微腹泻，表明LPS成功诱导了大鼠的发热模型，与邹甜［2］、高阳［3］前期报道一致。模型组与空白组比较，模型组大鼠体温明显升高，每个时间点差异均有统计学意义（P＜0.01），亦说明造模成功。

表1 各组大鼠体温△T比较（℃，±s）

表1 各组大鼠体温△T比较（℃，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，△P＜0.01。 下同。

组 别 n 0.5 h 1.5 h 2.5 h 3.5 h 4.5 h 5.5 h 6.5 h空白组 8 -0.04±0.23 0.12±0.18 0.08±0.180.18±0.20 0.11±0.25 0.09±0.30 0.06±0.26模型组 8 0.64±0.36 0.74±0.17△ 0.92±0.21△ 0.81±0.21△ 0.72±0.35△ 1.04±0.33△ 0.75±0.28△阳性对照组 8 0.39±0.27 0.21±0.31**0.20±0.19**0.45±0.21**0.44±0.23**0.51±0.26*0.50±0.26*三阳清解液高剂量组 8 0.21±0.42**0.61±0.93 0.58±0.61**0.36±0.41**0.40±0.47**0.30±0.46**0.34±0.33**三阳清解液中剂量组 8 -0.56±0.36**-0.03±0.73**0.17±0.54**0.39±0.37**0.54±0.30*0.64±0.26**0.51±0.18*三阳清解液低剂量组 8 0.04±0.16**0.56±0.38*0.74±0.38*0.57±0.43*0.61±0.27 0.79±0.27*0.67±0.35

2.2 给药后各组大鼠血清中细胞因子水平比较 见表2。造模给药6.5 h后，模型组动物血清中IL-6、MIP-1含量较空白组升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组及三阳清解液高剂量组能够减低发热大鼠血清中 IL-6、MIP-1 的含量（P＜0.01），三阳清解液中剂量组对发热大鼠血清中IL-6、MIP-1的水平也有一定的抑制作用（P＜0.05）；而三阳清解液低剂量组对发热大鼠血清中IL-6的水平有抑制作用 （P＜0.05），但MIP-1的水平无明显降低。

表2 各组大鼠血清中IL-6、MIP-1水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠血清中IL-6、MIP-1水平比较（pg/mL，±s）

组 别 n IL-6 MIP-1空白组 8 193.66±47.17 212.82±72.54模型组 8 276.52±35.40△ 327.46±43.56△阳性对照组 8 207.22±54.27** 235.90±75.42**三阳清解液高剂量组 8 213.15±35.64** 242.16±87.66**三阳清解液中剂量组 8 221.11±54.53* 268.96±85.07*三阳清解液低剂量组 8 228.98±52.55* 289.39±83.37

3 讨 论

发热是在致热性细胞因子作用下使体温调节中枢的调定点上移而引起的调节性体温升高，是儿科疾病常见的临床症状之一。IL-6、白细胞介素-1β（IL-1β）、MIP-1、肿瘤坏死因子（TNF-α）等，这些细胞因子及其受体之间相互联系、相互影响，作用于全身或局部从而参与发热反应，介导炎症过程、参与免疫调节、影响组织代谢等生物效应。尤其IL-1β、MIP-1和IL-6是公认的可诱导发热的重要炎性递质［4-8］。

目前一般采用注射某种致热源制作大鼠发热模型，本实验选用比较常用的、成熟的方法，采取尾腹腔注射LPS诱导大鼠发热。LPS是革兰阴性细菌内毒素的活性成分，有高度水溶性，动物体内能引起强烈的炎症反应，是导致发热效应很强的外源性致热源，它能够刺激机体产生内生性致热原，从而使体温升高［9-10］。经研究发现LPS诱导大鼠发热时注射剂量为20 μg/kg时可引起典型的双峰热，与前期报道［11-12］一致，且发热反应均匀、持续时间长，是造模的最佳剂量［13-15］。在预实验过程中我们参照前期报道［16］采用测肛温的方法，发现三阳清解液乙状结肠滴注时后反复测肛温会刺激大鼠肛门，引起不适，致灌肠药物流出，影响药物效果及体温测定，所以我们采用测口温的方法，此为创新点之一；另外，大鼠在灌肠过程中因为腹压过大等，造成滴注缓慢或不滴等现象，我们采用恒流泵泵入的方法解决这一问题，此为创新点之二；同时使用恒温水浴保证药物在37℃作用，此为创新点之三。

中医学认为小儿外感发热主要是感受风邪所致，有风寒、风热之分。因小儿是“纯阳之体”，感邪之后易于化热，故临床上风热证型最为常见。而小儿脏腑薄、藩篱疏，易于传变，往往太阳表证未解而病邪即入少阳半表半里，正邪交争，引动胆经郁热，上迫心神，横逆犯胃，而致小儿就诊时大多太阳、少阳、阳明诸症并见。三阳清解液正是在 《伤寒六书》柴葛解肌汤、《伤寒杂病论》的大柴胡汤、白虎汤基础上衍化而来，主要用于治疗小儿外感发热（风热夹滞型），方中柴胡轻清升散，黄芩清泻相火，和解少阳；葛根辛凉，解表入太阳；大黄泻热通便荡涤阳明腑热；石膏甘寒，清解阳明气分热邪；栀子苦寒，能清三焦湿热。全方共奏辛凉解表、和解少阳、清泻阳明之效。最妙在方中加入莪术，其意有四：一用其活血化瘀之功，增进药物的吸收；二用其消积行气之能，增强患儿的食欲；三取其苦温辛散之性，反佐上药过于寒凉之弊；四取其挥发油抑制病毒、细菌及增强免疫之效，从而全面提高药物疗效。

前期临床研究证实［1］三阳清解煎剂直肠滴注治疗小儿外感发热疗效显著，在治疗过程中没有观察到明显不良反应。在此基础上，本实验目的旨在探讨该三阳清解液的退热作用机制，从实验结果分析，三阳清解液各剂量组和对乙酰氨基酚对照组均对LPS发热大鼠模型有退热效果。三阳清解液各剂量组与模型组相比温度降低，差异有统计学意义，且退热效果存在一定的剂量依赖关系，三阳清解液高剂量组退热效果优于中剂量组和低剂量组。三阳清解液高剂量组能够明显减低发热大鼠血清中IL-6、MIP-1的含量，三阳清解液中剂量组对发热大鼠血清中IL-6、MIP-1的水平也有一定的抑制作用等，据此可认为三阳清解液具有降低LPS诱导大鼠发热模型血清中IL-6、MIP-1含量的功效，在一定剂量范围内，三阳清解液的这些功效与其药物剂量呈正相关。综上所述，三阳清解液对LPS诱导的发热大鼠模型有良好的解热作用，且有较好的剂量依赖性，其解热效果可能与其抑制发热大鼠血清中致热细胞因子IL-6、MIP-1的含量相关。

本实验对三阳清解液的作用机制进行了初步的探讨，但是致热细胞因子的作用机制非常复杂，其含量和作用也会相互影响，三阳清解液是如何抑制这些致热细胞因子产生和释放，是否通过影响信号转导过程而抑制合成等，有待今后进一步研究。

［1］ 王晓燕，马丙祥，陈宪忠，等.三阳清解煎剂直肠滴注治疗治疗小儿外感发热临床研究［J］.时珍国医国药，2007，18（4）：838-840.

［2］ 邹甜，田连起，叶晓川，等.大青龙汤对脂多糖致发热大鼠的解热作用研究［J］.中国现代中药，2012，14（11）：8-11.

［3］ 高阳，王志斌，左泽平，等.柴胡注射液对LPS发热模型大鼠解热药效的研究［J］.北京中医药大学学报，2012，35（10）：696-698.

［4］ Soares DM，Figueiredo MJ，Martins JM，et al.A crucial role for IL-6 in the CNS of rats during fever induced by the injection of live E.coli［J］.Med Microbio Immunol，2012，201（1）：47-60.

［5］ 平键，成扬，麦静愔，等.外感清热解毒方对发热大鼠血清炎症因子与下丘脑环氧化酶1和2蛋白表达的影响［J］.中国中医急症，2016，25（8）：1496-1499.

［6］ 王雪峰，韩雪梅，任存霞.王氏连朴饮加滑石、黄芩；茵达日-4味汤对温病湿热模型、炎性反应因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的影响［J］.世界中医药，2014，9（11）：1524-1527.

［7］ 孙晓卉，杨志航，孙大宇，等.柴胡皂苷A对发热大鼠的降温作用及与cAMP、PKA的相关性［J］.中华中医药学刊，2016，34（10）：2534-2536.

［8］ 左泽平，王志斌，高阳，等.柴胡注射液对LPS发热大鼠解热机制的研究［J］.中药药理与临床，2012，28（4）：59.

［9］ Bibek Khanal，施蓓，Puja Paudel，等.脑室给予不同剂量的Capsazepine对LPS致大鼠发热过程的影响［J］.中国药理学通报，2015，31（1）：35-38.

［10］高静飞，安祥，刘广元，等.含对乙酰氨基酚的感冒药及柴芩清宁胶囊对脂多糖和干酵母大鼠发热模型的解热作用研究［J］.药物评价研究，2017，40（2）：184-187.

［11］屈飞，徐镜，崔艳茹，等.麻杏石甘汤对LPS诱导的大鼠发热模型的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：178-181.

［12］袁岸，李燕，罗林，等.连翘提取物对酵母和脂多糖所致大鼠发热模型的影响研究［J］.辽宁中医杂志，2017，44（2）：405.

［13］韩玲，赵一粒.热必清颗粒对发热模型大鼠体温及血清IL-1β 影响的实验研究［J］.湖南中医杂志，2016，32（10）：174-189.

［14］罗世兰，王建，文静，等.基于中医动态观监测三种冰片对发热模型大鼠体温的影响［J］.时珍国医国药，2016，27（3）：521-523.

［15］陈财德，贾慧文，高明.复制临床发热症状动物模型的研究进展［J］.中国中医急症，2013，22（10）：1755．

［16］史正刚，李玉霞，李洁，等.热立清直肠滴注液对实验性发热大鼠体温及下丘脑中IL-1β和cAMP含量的影响［J］.中医儿科杂志，2009，5（5）：11-15.