自噬介导的肿瘤相关巨噬细胞调控机制的研究进展

张 培 曹守波 综述 于 雁 审校

自噬指细胞内的单层或双层膜结构包裹受损的细胞器、蛋白质和病原体形成自噬体，然后与溶酶体融合并导致自噬体降解的过程。自噬活动在维持肿瘤细胞的物质和能量代谢、增强肿瘤细胞运动和侵袭能力、促进肿瘤细胞休眠和免疫逃逸、调控基质细胞分化等方面的功能正在被广泛的研究。巨噬细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的前体细胞，能被肿瘤细胞募集、调控分化成为TAMs而促进肿瘤的转移。自噬机制涉及造血干细胞(HSCs)持续分化、单核细胞募集、单核细胞向巨噬细胞分化以及巨噬细胞极化成TAMs的每个调节步骤。本文就自噬介导的TAMs调控机制的研究现状做一综述。

1 自噬的调节

自噬是真核细胞生物中广泛存在的分解代谢途径，通常在饥饿、缺氧、氧化应激等条件下被诱发。自噬降解途径为不能从外环境获得足够营养物质进行生物合成的细胞提供氨基酸、核苷酸和脂肪酸，实现物质再利用，维持细胞内环境的稳态和细胞生存。自噬过程包括诱导、延伸、包裹、成熟和降解，调控机制复杂，涉及一系列与自噬相关的多种蛋白质(ATG蛋白)的调控[1]。首先在起始阶段由ULK1、FIP200蛋白和ATG13蛋白构成初始膜结构复合物，受哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的调节。mTORC1在正常代谢情况下处于活化状态，使ULK1和ATG13蛋白磷酸化而降低其活性，抑制初始复合物的形成。AMPK通路是mTORC1的上游信号通路，在缺氧或供能不足的情况下被激活，抑制mTORC1的活性，促使初始复合物的形成及自噬的发生。mTORC1抑制或AMPK的激活在初期复合物形成中起主要作用[2]。起始复合物形成后吸引并激活另一个复合物Beclin1，包括Beclin1、Ⅲ类PI3K、Bcl-2家族蛋白和激酶蛋白Vps15。复合物Beclin1刺激细胞产生磷脂酰肌醇3-磷酸，进而诱导自噬小体膜的形成[3]。

自噬体形成的延伸期和成熟期由两种独立但互补的泛素样途径控制：ATG5-12蛋白系统和LC3-PE蛋白系统。ATG7的活性半胱氨酸残基通过硫酯键与ATG12连接，将ATG12转移到ATG10，然后传递至ATG5。最后ATG5-ATG12复合物与ATG16L形成吞噬体稳定所需的多聚体复合物，并结合在自噬小体的外膜促进其延伸，待自噬体完全形成后脱落。LC3-PE复合物连接途径从半胱氨酸蛋白酶ATG4裂解LC3羧基端氨基酸残基之后开始。裂解后的LC3暴露其氨基乙酸末端，然后与ATG7相互作用，并经ATG7转移至ATG3。先前形成的ATG5-ATG12-ATG16L复合物将LC3与磷脂酰乙醇胺(PE)结合形成LC3-PE复合物(也称为LC3-II)[4]。这种新形成的复合物LC3-II促进自噬体与溶酶体的融合，形成双膜囊泡，在自体蛋白质作用下，两个单位的膜完全融合。

起始复合物的活性还受PI3K-Akt-mTOR、LKB1-AMPK-mTOR等信号通路的调控[5]。在能量缺乏、低氧情况下，Bcl-2家族蛋白特定的结构域BH3和BNIP3释放Beclin1，参与细胞自噬过程[6]。另外，凋亡相关蛋白激酶(DAPK)的自噬基因Beclin1 BH3结构域的磷酸化也可导致Beclin1与Bcl-2分离[7]。属于蛋白激酶的c-Jun氨基末端激酶(JNK)家族通过对Bcl-2的直接磷酸化破坏复合体，降低其对Beclin1亲和力[8]。所有这些步骤对代谢过程中自噬的调控至关重要。

2 肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤的发生、发展不仅取决于肿瘤细胞，还与肿瘤细胞周围的各种基质成分密切相关。这些基质成分包括各种基质细胞、细胞因子及趋化因子[9]。基质细胞中的CD4+Th1和CD8+T起到抗肿瘤作用，而TAMs、CAFs、Th17细胞与TNF-α、TGF-β和IL-10等大量炎性细胞因子通过诱导肿瘤血管生成、获得免疫逃逸和侵袭能力促使肿瘤生长和远处转移[10-11]。在众多的炎性免疫细胞中TAMs在数量和功能上都有着举足轻重的地位[12]。肿瘤细胞产生的CSF-1、IL-6、CCL2等趋化因子募集血管中的单核细胞进入肿瘤微环境，经分化形成巨噬细胞。巨噬细胞是TAMs的前体细胞，具有分化不稳定性，经不同的细胞因子诱导分化为M1型(经典活化型)和M2型(选择活化型)巨噬细胞。实体肿瘤中M2型巨噬细胞比M1型巨噬细胞的表达水平高，经过进一步研究发现M1型巨噬细胞的激活针对免疫应答细胞内微生物和肿瘤细胞Th1应答的刺激，而M2型巨噬细胞是免疫抑制性细胞，促进血管生成和肿瘤生长[13-14]。目前普遍认为TAMs是极化的M2型巨噬细胞[15]。

TAMs可以通过多种途径促进肿瘤的生长、侵袭和转移，如通过抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性功能及正常抗原递呈，参与调节肿瘤免疫逃逸[16]；分泌MMP9、MMP13、TGF-β、组织蛋白酶等降解ECM成分，使肿瘤细胞更易扩散[17]；分泌VEGF-A、VEGF-C促进肿瘤血管和淋巴管形成[18]；诱导EMT生成，使肿瘤细胞能够获得更大侵袭和转移能力[19]；此外，TAMs高表达还与多种肿瘤对化疗药物耐药及预后不良相关[20-21]。据Chen等[22]的研究，肿瘤组织中M2型巨噬细胞高表达人群较低表达人群的生存率更低。

3 自噬介导的TAMs调控机制

3.1 自噬在造血干细胞中的作用

骨髓中的造血干细胞(HSC)通常处于休眠和非分化状态，在特定的刺激下分化成各种类型的血细胞。TAMs半衰期极短，需要骨髓HSCs持续分化产生单核细胞维持肿瘤微环境中的高TAMs水平。在HSCs分化过程中，活性氧(ROS)逐渐积累。作为重要的第二信使，正常水平的ROS是调节HSCs增殖和分化必不可少的，过量的ROS会引起氧化应激，引起细胞器、DNA的氧化损伤，导致细胞结构和功能的破坏甚至细胞死亡[23]。骨髓中HSCs与其他类型的细胞相比更容易受到ROS的影响。最近的一项研究报道小鼠造血干细胞线粒体内过多的ROS会触发自噬活性；而在自噬完全缺陷的小鼠HSCs分化不受ROS抑制[24]。进一步研究发现ROS可以激活AMPK的上游调控因子LKB1，通过LKB1-AMPK信号通路调节抑制mTOR活性，诱导自噬的发生，清除代谢活化的细胞器、控制氧化代谢过程、负反馈调节ROS和维持ROS正常水平[25]。此外使用抗氧化剂NAC后，Akt去磷酸化作用减弱，说明ROS也可以通过抑制Akt/mTOR调节HSCs中的细胞自噬活性[26]。Mortensen等[27]报道，敲除小鼠造血系统中ATG7或FIP200导致HSCs功能缺陷，骨髓异常增生；体外实验显示ATG7敲除造成HSCs集落形成能力降低，这些结果表明自噬在维持HSCs自我更新和分化功能中起重要作用。

3.2 自噬在CCL2诱导单核细胞及巨噬细胞募集中的作用

人类血液中单核细胞的半衰期约为3天，在没有刺激的情况下发生凋亡。肿瘤细胞和基质细胞释放趋化因子和细胞因子募集单核细胞进入肿瘤微环境中。CCL2是最主要的趋化因子，其介导的单核细胞及巨噬细胞募集在促进肿瘤进展中起到了重要的作用。多项研究显示CCL2的表达伴随着自噬活性的改变。CCL2通过上调抗凋亡蛋白，诱导自噬在单核细胞中的活化，使单核细胞免于凋亡[28]。在前列腺癌中，CCL2可以防止雷帕霉素引起的自噬性细胞死亡，而乳腺癌细胞中CCL2的低表达增强了乳腺癌细胞的自噬[29-30]。然而，CCL2如何通过自噬调节肿瘤微环境中的单核细胞及巨噬细胞募集的机制需要进一步深入的研究。

3.3 自噬在单核细胞向巨噬细胞分化中的作用

CSF1、CSF2是诱导单核细胞分化成巨噬细胞的另两个主要的细胞因子。CAMKK2-PRKAA1-ULK1途径的激活在CSF1诱导自噬和介导人类单核细胞分化中必不可少。CSF1可促进嘌呤能受体P2RY6的表达，使ULK1的表达和磷酸化增加进而激活细胞自噬，促进巨噬细胞的存活和浸润。敲除小鼠ATG7基因后，ATG7蛋白表达缺失，小鼠自噬功能缺陷，CSF1驱动单核细胞分化成巨噬细胞的过程被阻碍[31-32]。CSF1诱导的单核细胞分化成巨噬细胞还需要通过调节Akt信号通路激活Caspase3和Caspase8。Caspase家族是一类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，通过切割不同的ATG蛋白产生不同的功能活性片段，在介导自噬和细胞凋亡之间复杂的相互作用中起着关键作用，推动自噬与细胞凋亡之间的转换[33]。CSF2通过活化巨噬细胞MAPK/JNK途径和诱导Bcl-2与Beclin1的解离激活自噬，而阻断上述自噬途径后可以抑制CSF2诱导的单核细胞向巨噬细胞的分化[34]。总之，自噬在单核细胞向巨噬细胞分化中也起了一定作用。

3.4 自噬介导的巨噬细胞活化及TAMs极化

Cat S是肿瘤微环境中巨噬细胞表达最多的半胱氨酸蛋白酶，其高水平表达与人类结肠癌预后不良有关。通过研究发现Cat S与巨噬细胞中自噬体标记物LC3表达呈正相关，通过上调Arg-1、FIZZ1和IL-10等TAM特异性基因的mRNA表达水平，促进巨噬细胞向TAMs的活化[35]。

细胞内信号通路mTOR参与调节巨噬细胞的极化过程。mTOR是一种进化上高度保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，通过控制自噬调节细胞生长和增殖。mTOR信号通路是M1和M2极化中的一个关键因素。活化的mTORC1通过磷酸化ULK1来抑制自噬，雷帕霉素抑制mTORC1，是自噬的强诱导剂。在受LPS刺激的单核细胞中，雷帕霉素抑制mTOR通路导致单核细胞朝向M1表型分化，而敲除mTOR内源性抑制剂TSC2则导致单核细胞分化成M2型巨噬细胞。这些发现支持TSC2-mTOR途径调节的自噬是单核细胞分化为TAM M2表型中的决定因素[36-37]。CCL2和IL-6通过抑制Caspase8水解来增强自噬，进而促进骨髓单核细胞的存活及向M2型巨噬细胞分化。在CCL2或IL-6刺激下，人外周血分离的CD11b+细胞显示甘露糖受体(CD206)和CD14+/CD206+双阳性细胞显著增加，表明巨噬细胞朝向CD206+M2表型分化。两种细胞因子诱导抗凋亡蛋白cFLIPL、Bcl-2和Bcl-XL的上调，抑制Caspase8的水解，促进巨噬细胞自噬，增加M2巨噬细胞的极化。这与使用Caspase8抑制剂模拟细胞因子诱导自噬和M2极化上调的结论一致[38]。

4 小结和展望

自噬有助于微环境中的肿瘤细胞克服代谢压力，维持其在不良理化环境中的生存。自噬还参与肿瘤微环境中TAMs产生的各个环节，包括调节HSCs持续分化、单核细胞募集、单核细胞向巨噬细胞分化以及巨噬细胞极化成TAMs的所有步骤。而TAMs表达的一系列细胞因子、趋化因子和蛋白酶可以促进血管生成，有利于肿瘤生长转移。因此，通过控制单核细胞及巨噬细胞中的自噬来减少M2型TAMs的生成，调节M2/M1型巨噬细胞的比例，有希望成为新的抗肿瘤治疗方法。目前虽然许多自噬相关疗法已经被证明是有效的，但自噬在肿瘤中的作用非常复杂，肿瘤微环境诱导自噬在不同肿瘤细胞和肿瘤不同阶段中的作用不尽相同，因此，还不能确定靶向自噬是一种可靠的肿瘤治疗方式，未来需要更多关于自噬与TAMs在塑造肿瘤微环境中作用的充分研究。

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