重组人超氧化物岐化酶基因工程菌稳定性研究

李敏　侯增淼　李晓颖　何越

摘 要：目的：研究重组人超氧化物岐化酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定性。方法：基因工程菌连续传代50次，每10代取样保藏菌种，通过对菌株形态、菌落形态、质粒稳定性、目的基因的PCR鉴定，蛋白表达的SDS-PAGE鉴定来评价工程菌的稳定性。结果：在连续传代50代的过程中，菌株、落形态与原始工程菌相比无明显差异，质粒保有率高，PCR鉴定结果显示，重组载体携带目的基因传至50代未消失，SDS-PAGE结果表明，传至50代蛋白表达量无明显差异。结论：该工程菌有良好的遗传稳定性。

关键词：重组人超氧化物岐化酶；毕赤酵母工程菌；遗传稳定性

中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）04-0011-02

Abstract： Objective： to study the genetic stability of recombinant human superoxide dismutase Pichia pastoris. Methods： the genetically engineered bacteria were subcultured for 50 times， and the preservation strains were sampled every 10 generations. The morphology of the strain， colony morphology， plasmid stability and target gene were identified by PCR. SDS-PAGE analysis of protein expression was used to evaluate the stability of engineering bacteria. Results： there was no significant difference in the strain and colony morphology between the original engineering strain and the original engineering strain in the course of successive subculture for 50 generations. The plasmid retention rate was higher than that of the original engineering strain. The results of PCR identification showed that the plasmid retention rate was high. The result of SDS-PAGE showed that there was no significant difference in the expression of protein from the recombinant vector to the 50th generation. Conclusion： the engineering strain has good genetic stability.

Keywords： recombinant human superoxide dismutase； engineered Pichia pastoris； genetic stability

超氧化物歧化酶是生物體防御氧化损伤的一种十分重要的生物酶，具有清除体内氧自由基的能力，能较好地抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞质膜的毒性[1]，在机体保护方面起重要作用，在医药与化妆品方面有很好的应用前景。巴斯德毕赤酵母具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点，在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达[2-3]。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，且培养基中不含其他蛋白，分泌的外源蛋白占了培养液中蛋白的绝大部分，十分有利于蛋白的分离和纯化[4-6]。实验室以pPIC9K为载体，成功将人超氧化物歧化酶基因转入巴斯德毕赤酵母GS115，构建了人超氧化物岐化酶毕赤酵母工程菌株GS115-9K-SOD，该实验旨在考察工程菌株的遗传稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

GS115-9K-SOD，由本公司构建和保存。

1.1.2 试剂

标准相对分子量DNA，购自Thermo Fisher Scientific；标准相对分子量蛋白质，26632，购自Thermo Fisher Scientific；G418，购自MP BIOmedicals；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺，购自上海生化试剂抚生有限公司；酵母粉，蛋白胨，购自Oxoid；YNB，购自上海伟进生物科技有限公司。

1.1.3 仪器

PCR仪，BIO-RAD公司；垂直电泳仪DYCZ-24DN型，水平电泳仪DYCP-31DN型，北京六一仪器厂。

1.1.4 培养基

YPD液体培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；YPD固体培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；MD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉20g/L，YNB13.4g/L，生物素（4×10-4）g/L；G418-YPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，G4184g/L；BMGY培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液，生物素（4×10-4）g/L，甘油10g/L；BMMY培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液，生物素（4×10-4）g/L，甲醇30g/L。endprint

1.2 方法

1.2.1 菌种传代方法

将冻存于-80℃冰箱中的第0代工程菌在室温下自然解冻，用接种环挑取菌种在YPD平板上划线分离单菌落，29℃恒温培一周，挑取划线培养分离的单菌落接种于3ml新鲜的YPD液体培养基中，29℃，220rpm，振荡培养24h，取30μl转接于3ml YPD液体培养基，29℃，220rpm，振荡培养24h为10代，在此基础上重复一次为20代，分别重复到5次为50代，第代菌种都于25%的甘油溶液中保藏。

1.2.2 菌落形态

在传代的过程中，10、20、30、40、50代取1μl菌液于倒置显微镜下观察菌体形态，将各代的菌液稀释100000倍，取100μl涂布YPD固体平板，29℃静置培养3-5天，观察菌落形态。

1.2.3 质粒稳定性

分别取10、20、30、40、50代的菌液1μl，稀释50000倍，取100μl涂布MD固体平板，29℃静置培养3-4天，挑取100个单菌落接种于G418平板上，29℃静置培养4-6天，读取平板上生长的菌落数，计算含质粒菌落所占的百分数。

1.2.4 目的基因的PCR鉴定

将各代的菌液稀释50000倍，取100μL涂布YPD固体平板，29℃静置培养2-4天，待平板长出均匀的单菌落后，用冻融法裂解菌体释放基因组DNA，步骤如下：（1）对每一株单菌落利用接种环挑取部分菌至100μl PBS中，混匀10000r/min离心3min，弃上清；（2）液氮中冷冻5min；（3）沸水浴5min；（4）重复（2）（3）步骤两次；（5）加入100ul PBS重悬；（6）10000r/min离心3min，收集含有基因组DNA的上清液。

以提取的基因组DNA为模板，使用设计合成的一对特异性引物，进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.5 工程菌的表达稳定性SDS-PAGE鉴定

分别取0、10、20、30、40、50代的菌液3μL接种于30mLBMGY培养基中，29℃，210r/min，摇床培养48h，取10mL菌液，3000r/min，4℃离心5min，弃上清，菌体加入10mL无菌水重悬洗涤一次，3000r/min，4℃离心5min，弃上清，转入30mL BMMY培養基培养，29℃，210r/min，摇床培养，每天定时补甲醇300μL，诱导蛋白表达，诱导4天后，离心收集上清液，弃菌体，加入5*SDS上样缓冲液，煮沸5min，用15%浓度的SDS-PAGE进行电泳检测。

2 结果

2.1 菌落形态及质粒稳定性

在连续培养50代的过程中，通过在倒置显微镜的观察可见，菌体呈饱满的球型，并伴有芽孢出现，无其他变异形态出现。在YPD平板上培养50代的过程中，菌落呈光滑整齐的圆形隆起，乳白色，边缘均匀整齐，湿润，无杂菌生长。

本文考察了50代的质粒稳定性，在传代50代的过程中质粒保有率仍可达100%，说明在有选择压力的培养基中传代，质粒可以稳定的保留。

2.2 目的基因的PCR鉴定

以每代提取的基因组DNA为模板，用一对特异性引物进行PCR扩增，结果如图1所示，各代均在500bp左右有一清晰条带，大小与目的片段相符，且10-50代结果与0代一致。

2.3 表达稳定性SDS-PAGE鉴定

各代菌种在诱导表达后，对发酵上清液进行SDS-PAGE检测，电泳结果如图2所示，在18KDa左右有一明显的表达蛋白条带，其大小与目的蛋白理论值基本一致，且表达量10-50代与0代差异不大。

3 结束语

基因工程菌的遗传稳定性直接影响重组蛋白的表达，分离纯化，乃至后期的产业化生产，本公司通过对构建的重组人超氧化物岐化酶基因工程菌传代50代内的遗传稳定性进行考察，结果表明：菌种在传代50代的过程中，菌株形态、菌落形态均无明显改变，重组质粒稳定，保有率高，无缺失或变异现像发生，目的蛋白表达量也具有良好的稳定性，为后面大规模的发酵生产提供了有利保障。

参考文献：

[1]周宇飞，周峻岗，等.人超氧化物歧化酶一胸腺素α1融合蛋白在毕赤酵母中的表达与活性检测[J].复旦学报（自然科学版），2011，50（2）：178-183.

[2]丁镌，宋跃芬，等.毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策[J].畜牧与兽医，2017，39（2）：57-59.

[3]朱泰承，李寅.毕赤酵母表达系统发展概况及趋势[J].生物工程学报，2015，31（6）：929-938.

[4]Ahmad M， Hirz M， Pichler H， et al. Protein expression in Pichia pastoris： recent achievements and perspectives for heterologous protein production[J].Appl Microbiol Biotechnol，2014，98（12）： 5301-5317.

[5]傅小蒙，孔令聪，等.毕赤酵母表达系统优化策略概述[J].中国生物工程杂志，2015，35（10）：86-90.

[6]赵炎葱，李景华，等.不同培养基对毕赤酵母工程菌生长的影响[J].中国医疗前沿，2013，8（7）：35-36.endprint