超速离心机技术原理与操作维护注意事项

黄靖娴

摘 要：文章以贝克曼库尔特有限公司的Optima XPN-100超速离心机为例，主要论述超速离心机相关离心技术，转头、容器的选择因素以及常规使用维护注意事项，为离心机管理人员及实验人员提供有用的参考，保障实验室离心机的正常使用，更好地提升离心机的使用效率。

关键词：超速离心机；离心技术；操作；维护

中图分类号：Q-33 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）36-0130-03

Abstract： Taking the Optima XPN-100 ultracentrifuge of Beckman Coulter Co.， Ltd as an exemplar， this paper mainly discusses the centrifuge technology related to the ultracentrifuge， the selection factors of the rotating head and the container， and the matters needing attention in routine use and maintenance. For centrifuge managers and laboratory personnel to provide a useful reference to ensure the normal use of laboratory centrifuges and improve the efficiency of the use of centrifuges.

Keywords： ultracentrifuge； centrifuge technology； operation； maintenance

前言

超速离心机是通过驱动转头高速旋转产生的离心力场对样品中不同沉降系数或浮力密度值的混合物质进行快速分离、浓缩和提纯的专门设备，最高转速不低于30，000rpm。超速离心技术广泛应用于大分子、细胞、细胞器等的分离、纯化，是生物化学和分子生物学不可缺少的技术手段[1]。在现代科学研究中，超速离心分离技术日趋重要。

1 超速离心分离技术原理

超速离心分离技术在应用上可分为制备型超速离心和分析型超速离心两大类。其中制备型超速离心是浓缩与纯化各种颗粒的最常用方法，而根据相对离心力与被离心物质间的相互作用方式不同，超速离心法可分为差速离心法和密度梯度离心法[2]。以贝克曼库尔特有限公司的Optima XPN-100的制备型超速离心机为例，其应用范围主要有病毒及亚细胞组份分离，蛋白梯度分析，脂蛋白分离，RNA梯度沉淀，质粒DNA提纯，外泌体纯化与分析等。以下将着重论述制备型超速离心技术的应用原理。

1.1 差速沉降离心

差速沉降离心利用离心样品组分中各颗粒的大小和密度不同而存在沉降速度的差别，经一定时间的相对离心力作用，各颗粒先后沉降以达到分离纯化的目的，被广泛应用于样品的粗提纯和浓缩。待分离的颗粒间的沉降系数差值需足够大（一般为1到几个数量级），否则分離效果不佳[3]。

离心过程中，样品将分离为两部分，即沉淀物和上清液。取出上清液后，可加大转速对上清液进行再离心，从而再次得到沉淀和上清液。如此多次离心处理，可完成样品中不同颗粒的分离。

此法要注意掌握好离心时间和离心力，时间过长或相对离心力过大都会造成杂质颗粒沉降下来，影响分离效果，另外，沉淀于管底的颗粒容易受挤压而变性失活。所得到的沉淀中会有其他颗粒，不能一次得到纯颗粒，需对沉淀进行多次再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。

差速沉降离心法被广泛应用于各类生物样品，如血清、血浆、细胞培养液、尿液、唾液和脑脊液等的分析，是目前外泌体分离方法的“金标准”[4]。

1.2 密度梯度离心

密度梯度离心是把样品颗粒加入到有密度梯度的惰性介质液（如氯化铯、蔗糖等）中，利用颗粒与介质的密度值不同，在一定的相对离心力作用下，使样品中不同种类颗粒分别集中到梯度介质中某些特定位置上，最终得到不同的区带，从而可以从不同的区带中分别收集到纯度高的各种颗粒。

本法适用于沉降系数相差不大的颗粒的分离。如果沉降系数值相差一个数量级以上，一般用差速离心法就可以满足分离需要[5]。

密度梯度离心可一次获得较纯的颗粒，适应范围也较广，既能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离具有一定密度差的颗粒，颗粒也能保持活性，不会挤压变形。同时，密度梯度离心中惰性梯度介质对流性差，从而可以防止分离后的各区带间相互混合。但此法需要制备惰性梯度介质溶液，离心时间一般较长，操作也相对复杂。

1.2.1 速率区带离心（差速区带离心法）

用于大小、形状不同而密度相近的样品颗粒（即存在一定的沉降系数差）的分离。

先将介质液加入离心管，形成一个连续的自上而下逐渐增大的密度梯度系列层，再将样品颗粒加在梯度介质液面上，介质液常用蔗糖、甘油和Ficoll等，其最大密度一般小于样品中各组份的密度。在一定时间的相对离心力作用下，颗粒各自以不同的速度沉降，最终在梯度介质液形成依据沉降系数大小由下至上的区带。颗粒的沉降系数越大，向下沉降越快，呈现的区带也越靠近管底部。

此法关键在于精确设定离心时间，应在各区带间距离达到最大时立即停止离心，不能超过沉降最快的大颗粒到达管底的时间，否则将造成样品中密度值相近而沉降系数相远的颗粒集中在同一区带内，从而影响分离纯化效果[6]。

1.2.2 等密度离心

本法是使样品中密度不同的各种颗粒分别集中在相应密度的梯度介质液中，从而得到分离纯化。此法离心效果与颗粒的大小、形状无关，仅与密度值有关，颗粒间密度差值越大，分离效果越好。离心时间宜长不宜短，通常大于速率区带离心法。

离心样品可加到密度梯度介质液的任何位置，在相对离心力的作用下，由于密度值的不同，样品颗粒在介质液中将向下或向上分离，当颗粒到达位置的介质液的密度与颗粒的浮力密度相等时，颗粒受力达到平衡，便在此处形成富集条带。介质液有氯化铯、蔗糖、甘油以及Percoll等，可采用连续梯度，也可是不连续梯度。采用连续梯度时，密度梯度介质液密度范围应包括所要分离的各种颗粒的密度；采用不连续梯度时，先将样品中的较重的颗粒在可以满足的离心条件下预先分离除去，再把含有所需颗粒的上清部分置于具有相等密度的不连续梯度介质中离心沉降，密度值低于介质的颗粒将上浮而被除去。

等密度离心适用于分离整细胞、亚细胞组分、核酸、蛋白复合体以及病毒等。

2 离心转头和容器的选择

离心机最常配置的转头是固定角转头和水平转头，例如，Optima XPN-100超速离心机固定角转头包括Type 19Ti、Type 25Ti、Type 45Ti、Type 70Ti、Type 90Ti、Type 100Ti等10个型号，对应最高转速从19，000rpm到100，000rpm，水平转头则有SW 28Ti、SW 32Ti、SW 41Ti、SW 60Ti等8个型号，对应最高转速从28，000rpm到60，000rpm，此外还有垂直转头、近垂直转头、连续流/区带转头等可供选择。转头的选择主要依据实验对离心技术的需求。

固定角转头离心管与转子的转轴之间有一定的角度（通常在14°-45°），选用固定角转头以差速沉降离心分离沉降速度有明显差异的样品最有效。

水平转头在转头静止时，处于转头中的离心管中心线与旋转轴平行，转头旋转时，离心管中心线由平行位置逐渐过渡到与旋转轴垂直。使用水平转头时，颗粒移动距离长，相应的离心时间也较长。样品做速率区带离心（差速区带离心）优选水平转头，等密度离心则两种转头都可选择。

垂直转头的离心管垂直插入转头孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行，此种转头中样品颗粒移动距离短，相应离心时间也短，主要用于样品在短时间做等密度离心。

超速离心机有各种式样的离心容器可供选择，包括一些特别的离心管，如指封管（OptiSeal）、圆锥形密封管（Konical）、高离心力管（g-max）和快封管（Quick-Seal）等。离心容器的选择，除要考虑离心容器的式样、容量外，还需要考虑离心管材质与样品和溶剂的兼容性。常用离心容器的材质有聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚丙烯和聚乙烯聚合物（Polyallomer，PA）、聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）、超净（Ultra-Clear，UC）、聚乙烯（Polyethylene，PE）、丙酸纤维素（Cellulose Propionate，CP）、不锈钢（Stainless Steel，SS）。各种材质的离心容器化学耐受性、物理性质及其适用的消毒灭菌方法详见表1和表2。

3 操作与维护中应注意事项

Optima XPN-100超速离心机最高转速可达100，000rpm，最大相对离心力为802，400×g，温度设定范围为0-40℃。在操作和维护过程中，需要注意以下事项：（1）生命科学、医学领域要离心的样品往往要求低温，为避免因离心过程中设备温度下降较慢而使得样品活性有所破坏，转头与吊管可提前放冰箱预冷，使用时再取出。（2）样品一定要配平，可两两配平（需要精确到千分之一克），对称放置转头或吊管内，放入样品前检查转头或吊管，确保无异物和液体。（3）水平转头的吊管要对号入座，全部挂上，并检查是否挂好。（4）安装转头前，要确保离心腔体无异物和液体；安装转头时，应垂直放在离心轴上，转头的盖子要拧紧。（5）仪器运行后，操作者要等到所设转速或相对离心力达到设定值，并且趋于稳定及运转正常时才可以离开，同时也要随时观察仪器运行情况。（6）使用完毕，取出转头并擦试清洁干净，置于干燥通风处；为让水汽蒸发，不要马上关闭离心机腔体盖，待腔体恢复近似室温，用清洁干毛巾擦干腔体，再拉上盖子。（7）不同型号的转头、离心管和吊管等配件要严格按照相应的操作说明使用，不能混用错配。（8）移动转头时，注意防止转头底部的转速识别花盘划花，如果有磨损可能造成转速上不去，此时应及时更换。（9）定期给真空泵、扩散泵换机油，保证真空系统的正常运行。（10）定期给离心机转轴和锁紧螺丝涂抹润滑脂，更换磨损过度的垫圈；离心机腔体盖边缘的O型橡胶圈涂真空脂，防止密封圈老化，并且定期检查有无变形。

4 结束语

在使用超速离心机时，实验人员应根据实验实际情况选择合适离心技术、离心转头和离心容器等，并严格按照超速离心机的操作规程正确使用，同时也需注重仪器的日常维护保养，保障超速离心机的稳定运转，充分发挥其使用效率。

参考文献：

[1]黄素梅，殷明，张春芳，等.超速离心机在公共实验平台发挥的作用[J].实验室研究与探索，2008（03）：29-30+58.

[2]崔泽实，郭丽洁，王菲，等.实验室离心技术与仪器维护[J].实验室研究与探索，2016，35（06）：269-272+276.

[3]周末，姚璐，高建，等.醫学实验室中离心机的应用与技术保障[J].中国医学装备，2015，12（05）：20-24.

[4]龚春梅，徐远飞，周继昌.外泌体分离与鉴定方法的研究进展[J].生命科学，2018，30（03）：319-326.

[5]李万杰，胡康棣.实验室常用离心技术与应用[J].生物学通报，

2015，50（04）：10-12.

[6]王媛，雷迎峰，丁天兵，等.超速离心机的操作及超速离心技术的应用[J].医学理论与实践，2013，26（16）：2144-2146.