肝脾舒对肝硬化大鼠肠屏障功能的保护作用

潘相学+祝峻峰+李勇

[摘要] 目的 探讨肝脾舒对肝硬化大鼠肠黏膜屏障的保护作用。 方法 雄性SD大鼠36只，基于SAS proc plan 语句，按照体重从小到大的顺序随机分为4组，每组9只。空白组每日腹腔注射生理盐水，模型组采用四氯化碳腹腔注射制备肝硬化模型，肝脾舒组和杜秘克组在模型组基础上每日分别给予肝脾舒或杜秘克灌胃。取血浆检测内毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）水平，取肝组织和回肠组织行HE染色观察病理变化。 结果 肝脾舒组血浆ET、DAO、TNF-α和IL-1β浓度明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）；肝脾舒组血浆DAO、IL-1β浓度明显低于杜秘克组，差异有统计学意义（P < 0.05）。肝脾舒组及杜秘克组的肝组织及回肠组织病理改变均优于模型组。 结论 肝脾舒对肝硬化大鼠肠黏膜屏障具有保护作用，可以截断对肠黏膜屏障的损伤，进而影响肝硬化的发展过程。

[关键词] 四氯化碳；肠黏膜；肝硬化；肝脾舒

[中图分类号] R287 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0021-04

[Abstract] Objective To explore the protective effect of Gan Pi Shu on intestinal mucosal barrier in rats with liver cirrhosis. Methods A total of 36 male SD rats were divided randomly into 4 groups based on SAS proc plan sentence according to the order of weight to be large， with 9 rats in each group. The rats in the blank group were injected intraperitoneally with saline daily. The rats in the model group were injected intraperitoneally with carbon tetrachloride to establish the model of liver cirrhosis. The rates in the Gan Pi Shu group and the Duphalac group were given Gan Pi Shu and Duphalac respectively based on the model group. The plasma levels of endotoxin （ET）， diamine oxidase （DAO）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） were measured. The pathological changes of liver and ileum tissue were observed by HE staining. Results The plasma levels of ET， DAO， TNF-α and IL-1β in Gan Pi Shu group were lower than those of model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. DAO and IL-1β in Gan Pi Shu group were lower than those of Duphalac group， with statistically significant difference （P < 0.05）. The pathological changes of liver and ileum tissue in Gan Pi Shu and Duphalac group was better than that of model group. Conclusion Gan Pi Shu has the protective effect on the intestinal mucosal barrier in rats with liver cirrhosis， which can truncate the development process between intestinal mucosal barrier dysfunction and cirrhosis.

[Key words] Diamine oxidase； Intestinal mucosa； Cirrhosis； Gan Pi Shu

肝硬化是臨床常见的慢性进行性肝病，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病等全身各系统并发症，病死率高。多项研究证实，肠屏障功能障碍与肝硬化并发症密切相关，在其发生、发展中起到了枢纽的作用[1-3]。肠源性内毒素血症（IETM）[4]是肝硬化患者常有的并发症，在内毒素（ET）的作用下，肠道黏膜下固有层的肥大细胞被激活，通过活化脱颗粒释放大量炎症介质如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，通过一系列的生理、病理变化促进肝硬化的发展[5]，最终造成肠屏障功能损伤—内毒素血症—肝损伤加重—多脏器衰竭的恶性循环[6-8]。因此，寻求有效的药物，截断肝硬化的发展，是当今医学界面临的重大课题。本研究应用中药肝脾舒治疗肝硬化获得了良好的效果，进一步阐明了该药的药效机制。现报道如下：

1 对象与方法

1.1 实验试剂

ET、TNF-α、二胺氧化酶（DAO）及IL-1β检测试剂盒：南京建成科技有限公司；四氯化碳（CCl4）：成都科龙化工试剂厂（生产批号：150508）。endprint

1.2 实验动物

SD大鼠36只，2个月大，平均体重（200±20） g，雄性，SPF级，由中国科学院实验动物中心（合格证号：2013000649953）提供。实验前于上海中医药大学附属上海市中医院实验动物中心适应性饲养1周，饲养条件：符合昼夜光线变化要求的房间，恒温（22～24℃）、恒湿（50%），所有大鼠均自由进水和进食。

1.3 动物造模

本研究应用CCl4的造模方法[9]，依据大鼠的体重分数，按0.3 mL/100 g的标准，每只大鼠给予40%CCl4溶液进行腹腔注射，首剂加倍（0.6 mL/100 g），隔日1次，持续注射90 d。

1.4 分组和处理

将大鼠按体重排序，基于SAS proc plan语句，36只大鼠被随机分为4组，分别为空白组、模型组、肝脾舒组和杜秘克组（阳性对照组），每组各9只。各组在造模同时给药，肝脾舒组给予肝脾舒20 mL/kg灌胃，药物组成：虎杖（批号：13060064）、生白术（批号：1305068）、枳实（批号：1305024）、当归（批号：1306015）、广郁金（批号：1303042），所有药物均为江阴天江药业有限公司生产的颗粒剂，按照30 g ∶ 9 g ∶ 9 g ∶ 6 g ∶ 9 g比例混合，加水200 mL调成）。空白组、模型组用同等容量的生理盐水灌胃。杜秘克组给予杜秘克（雅培生物科技公司，批号：253335），每日0.01 mg/kg灌胃。上述各实验组均连续给药90 d，各组大鼠均自由饮水，并应用普通饲料喂养。

1.5 检测指标与方法

造模90 d，用乌拉坦（1.25 g/kg）行腹腔麻醉，然后抽取血液、剪取肠道及肝脏组织，检测血浆ET、DAO、TNF-α和IL-1β，所有操作步骤严格按试剂盒说明书进行，应用723型分光光度计进行上述项目的检测。取肝右叶及回肠部分组织，于l0%中性甲醛固定，经石蜡包埋、切片、脱蜡水化，常规HE染色后，应用普通光镜观察肝组织及回肠组织的病理变化。

1.6 统计学方法

所有数据均采用Origin 8.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。两组间比较，当方差齐性时，采用组间t检验，方差不齐时，采用t'校正检验进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时用SNK-q法，方差不齐时用Dunnett′s T3法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型评价

模型组与空白组血浆ET、DAO、TNF-α和IL-1β含量比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），提示造模成功。见表1。

2.2 三组血浆ET、DAO、TNF-α和IL-1β含量比较

三组血浆ET比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。进一步两两比较，肝脾舒组ET水平低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）；与杜秘克组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。肝脾舒组DAO浓度低于模型组和杜秘克组，差异有统计学意义（P < 0.05）。肝脾舒组血浆TNF-α及IL-1β浓度均低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）；肝脾舒组TNF-α水平低于与杜秘克组，但差异无统计学意义（P > 0.05）；肝脾舒组IL-1β水平明显低于杜秘克组，差异有统计学意义（P < 0.05）。杜秘克组TNF-α明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 肝组织HE染色结果

空白组肝组织整体清晰、肝小叶分布正常，肝细胞排列规则，胞浆均匀，细胞核形态正常，肝血窦无异常改变。模型组大鼠的肝组织结构相对松散和更加紊乱，肝细胞存在大量的点状及灶状坏死，肝索模糊或消失，肝间质有大量的纤维组织增生，具有假小叶形成的特点。杜秘克组部分肝细胞发生气泡样变性，并有少量细胞发生了坏死，明显存在肝小叶結构破坏，存在较多的纤维组织增生，但形成间隔较少。肝脾舒组尽管仍存在肝小叶结构受损的特点，但只有少量的纤维组织增生，并有少数肝细胞发生了气泡样变性，未见假小叶形成。

2.4 回肠HE染色结果

空白组大鼠的肠绒毛组织结构比较完整，排列整齐。模型组大鼠肠绒毛长短不一、结构比较紊乱，与空白组比较，大部分绒毛具有明显缩短，部分出现断裂、坏死及脱落，大肠肌层增厚。肝脾舒组和杜秘克组的HE染色相似，主要表现为肠绒毛排列基本整齐，结构基本完整，脱落、倒伏情况明显好于模型组，只有部分绒毛存在局部变短的特点，肌层增厚。

3 讨论

现代医学认为，肝硬化的病因多为各种病毒侵袭人体（肝炎病毒属中医疫毒湿邪范畴），羁留体内，长期迁延不愈，或长期嗜酒酗酒，或长期恣食膏粱厚味等，导致肝脏代谢异常，形成肝硬化。因此，中医学认为，湿热邪毒是肝硬化的始动因素，并贯穿肝硬化的整个病机过程，而正气亏损是肝硬化发展的内在原因，其盛衰的转化是肝硬化转归的重要影响因素[10]。王灵台[11]教授早年以清肝为则组方“清肝颗粒”进行各种肝病的治疗，显著改善了患者的肝功能，并对病毒复制产生了明显的抑制作用。中医五行学认为，肝属木而脾属土，肝病实则木克土，易乘脾犯胃，造成脾胃虚弱。所以中医学有“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”的说法。“纳呆、腹胀、便溏”是肝硬化患者的常见症状，也是中医脾虚的典型症状，而事实上，这些症状与现代医学肠道的功能密切相关，提示现代医学的肠道、肝脏等脏腑共同囊括于了中医学的肝脾理论中。在此基础上，本研究以清肝实脾立法，组方肝脾舒，该方由虎杖、生白术、枳实、当归和广郁金五味基本药物组成，临床根据患者症状灵活化裁，用于病毒性、酒精性肝炎、肝硬化等各种类型肝病患者，疗效满意，明显缓解患者临床症状，有效防止并发症的发生。此外，该方还具有显著改善便秘患者肠道症状的作用[12]，起到了“四季脾旺不受邪”的临床治疗效果。endprint

肝脾舒方的君药为虎杖，虎杖的主要有效成分为虎杖苷、白藜芦醇以及大黄素等。研究认为，上述提取物有显著的抗EI作用[13]；白藜芦醇具有有效抑制TNF-α产生的药理效果，同时，在重症急性胰腺炎的发生中，该药还具有抗氧化作用[14]。另有研究显示[15-18]白藜芦醇可通过增加活性氧含量，强化氧化应激，降低线粒体膜电位，在多发性骨髓瘤H929、人肺腺癌A549、弥漫大B淋巴瘤及卵巢癌SKOV-3细胞中启动内源性凋亡途径，诱导肿瘤细胞死亡。其主要成份大黄素抗菌抗病毒并促进肠道平滑肌蠕动的药理效果目前已经被医学界广泛认可，能够显著发挥肠黏膜屏障的保护作用。另外，近年来的研究显示，大黄素在抗肝纤维化方面也表现出了明显的治疗效果[19]。还有实验表明[20]，大黄素尚可下调Wnt/β-catemin通路中的促血管生成因子表达从而抑制裸鼠结肠癌移植瘤的生长及微血管的形成。

本研究模型组肝组织HE染色的结果提示已经形成了肝硬化，另外，模型组血浆EI水平与空白组相比明显升高，提示模型组已经形成了IETM。与模型组比较，而肝脾舒组与杜秘克组肝硬化病理变化的程度均有不同程度的减轻，血浆EI水平也显著低于模型组。本研究结果显示，模型组大鼠回肠HE染色提示其肠黏膜机械屏障受到较严重的损伤，而肝脾舒组回肠组织的HE染色较模型组有不同程度减轻。由于DAO主要存在于小肠黏膜绒毛上层细胞中，是该类胞质中具有高度活性的细胞内酶，因此，通过检测血清中的DAO水平，能够早期反映肠道的黏膜屏障功能。TNF-α、IL-1β为炎症介质，其含量的增加显示局部或全身炎性反应，本研究结果显示，与空白组相比，模型组血清的ET、DAO、TNF-α、IL-1β水平明显升高，提示模型组的肠黏膜上皮层受到一定程度的损伤，并存在EI血症及全身炎性反应，肝脾舒组的血清DAO、ET、DAO、TNF-α、IL-1β水平较对照组低，提示中药肝脾舒能够减轻IETM，减轻炎性反应，对肠黏膜机械屏障、免疫屏障都具有一定的保护作用，这可能是肝脾舒减慢肝硬化进程的机制之一。

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（收稿日期：2017-09-18 本文编辑：王 娟）endprint