甘草苷对UVB诱导HaCaT细胞光老化的保护作用及机制研究

张丽宏+傅云+廖建

[摘要] 目的 研究甘草苷對中波紫外线（UVB）诱导人皮肤角质形成细胞（HaCaT）光老化的保护作用及机制。 方法 用不同浓度的甘草苷作用于HaCaT细胞，噻唑蓝比色（MTT）法筛选甘草苷的安全有效浓度；用30 mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞，建立光老化模型。用10-7、10-6、10-5 mol/L的甘草苷处理甘草苷+UVB组细胞24 h，MTT法检测甘草苷对光老化HaCaT细胞增殖率的影响；试剂盒检测HaCaT细胞中谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量；蛋白免疫印记法检测HaCaT细胞中白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白表达量。 结果 10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷对HaCaT细胞无明显的促增殖与抑制作用（P > 0.05），为最佳安全有效浓度。与空白组相比，UVB组细胞增殖率显著降低，GSH、CAT活性显著降低，MDA含量显著升高，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量显著升高（P < 0.01）。与UVB组相比，10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷+UVB组细胞增殖率显著升高，GSH、CAT活性明显上升，MDA含量显著降低，IL-1β 、IL-6、TNF-α蛋白表达量显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 甘草苷对UVB诱导的HaCaT细胞光老化有保护作用，其机制与其提高抗氧化酶活性，抑制炎性因子的产生有关。

[关键词] 甘草苷；中波紫外线；光老化；人皮肤角质形成细胞

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effects and the mechanism of liquiritin on photoaging human keratinocytes （HaCaT） cells induced by ultraviolet B （UVB）. Methods The different concentrations of liquiritin were used on HaCaT cells， the best effective and safe concentration of liquiritin was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）. The photoaging model was set up by the irradiation of UVB at irradiation dose of 30 mJ/cm2. It was used to treat liquiritin + UVB group cells 24 h with 10-7， 10-6， 10-5 mol/L， the effects of liquiritin on the proliferation rate of photoaging model HaCaT cells were detect by MTT. The activity of glutathione （GSH）， catalase （CAT） and the content of malondialdehyde （MDA） were detected by the corresponding kits. The detection of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） protein expression were detected by Western blot. Results The liquiritin with the concentrations of 10-7， 10-6， 10-5 mol/L had no obvious effect on the proliferation and inhibition of HaCaT cells （P > 0.05）， which were the best safe and effective concentrations. Compared with the blank group， the cell proliferation rate of the UVB group was significantly decreased， the activity of GSH and CAT was significantly decreased， and the content of MDA was significantly increased， the expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α protein were increased （P < 0.01）. Compared with the UVB group， the cell proliferation rates of the （10-7， 10-6， 10-5） mol/L liquiritin+UVB group were significantly increased， the activity of GSH and CAT was significantly increased， the content of MDA was significantly decreased， the expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α protein were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Liquiritin can protect HaCaT cells photoaging， which mechanism is related to the improvement of antioxidant enzyme activity and inhibition of inflammatory cytokines.endprint

[Key words] Liquiritin； Ultraviolet B； Photoaging； Human keratinocytes

皮肤光老化是指紫外线（UV）辐射造成皮肤干燥、粗糙、弹性缺失，皱纹增多和色素沉着，甚至诱导癌性病变等[1]。长期的UV辐射可破坏皮肤的屏障功能，减弱皮肤对外界刺激的抵抗力[2]。近年来，工业化的生产日益增加，环境的污染日益加重，臭氧层阻挡UV的能力减弱，辐射至地球表面的UV逐渐增多，由此导致皮肤光老化现象普遍增多[3]。随着人们对美容的重视，UV辐射造成的皮肤光老化越来越引起人们关注，探索中药预防及治疗皮肤光老化已成当今重点。

甘草，为豆科甘草属植物的根和根茎，甘草苷是甘草根部提取出的一种重要活性成分之一，现代研究表明，甘草苷具有抗氧化、抗过敏、调节机体免疫力、抑菌、抗抑郁和神经保护等药理作用[4]。查阅相关文献[5]，当UVB照射剂量为30 mJ/cm2时，即可导致HaCaT细胞光损伤，并且发生凋亡和坏死。因此，本实验采用30 mJ/cm2中波紫外线（UVB）辐射人皮肤角质形成细胞（HaCaT），制备光老化模型，用不同浓度甘草苷作用于光老化HaCaT细胞，研究甘草苷对光老化HaCaT细胞的保护作用及机制，为预防和治疗皮肤光老化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人皮肤角质形成细胞HaCaT（中乔新舟），丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170516）；谷胱甘肽（GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170619）；过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170526）；兔抗人β-actin单克隆抗体（博奥森生物有限公司）；兔抗人白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）多克隆抗体（博奥森生物有限公司）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）；甘草苷标准品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-16082811）。miniPROTEANTetra Cell電泳仪，BIO-RAD公司；Trans-Blot SD Cell半干转膜仪，BIO-RAD公司；Smart chemi Ⅱ型一体式微型化学发光成像仪，北京赛智创业有限公司。

1.2 药物的配制

根据公式C=n/v，精密称取甘草苷8.37 mg，用10 μL DMSO溶解后，再加入20 mL DMEM培养液混匀，配制成浓度为10-3 mol/L的药物母液，将母液依次稀释成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 mol/L的浓度，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

1.3 噻唑蓝比色（MTT）法筛选甘草苷安全有效浓度

细胞生长至对数期，以1×104个/孔将细胞接种至96孔板，200 μL/孔，每组设6个复孔，于37℃，5%CO2培养箱培养24 h后，随机分为空白组和甘草苷组。吸弃培养液，空白组加入200 μL培养液；甘草苷组加入200 μL不同浓度（10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L）甘草苷药液。培养24 h后，每孔加入20 μL MTT，孵育4 h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜（DMSO），150 μL/孔，于37℃恒温培养震荡器上震荡10 min，在酶标仪492 nm波长处测定吸光度值（OD）。细胞增殖率（%）=OD492给药组/OD492空白组×100%。

1.4 MTT法检测甘草苷对光老化HaCaT细胞增殖率的影响

96孔板内细胞培养24 h后，随机分为空白组、UVB组、（10-7、10-6、10-5 mol/L）甘草苷+UVB组。吸弃培养液，PBS洗2次，每孔加200 μL PBS，空白组使用铝箔纸覆盖，用30 mJ/cm2 UVB照射UVB组和甘草苷+UVB组，照射完毕，吸弃PBS，UVB组加入200 μL培养液，甘草苷+UVB组分别加入200 μL 10-7、10-6、10-5 mol/L的甘草苷药液，于37℃，5%CO2培养箱培养24 h后，每孔加20 μL MTT，孵育4 h，吸弃培养液，加入DMSO，150 μL/孔，37℃恒温培养震荡器上震荡10 min，在酶标仪492 nm波长处测定OD。

1.5 微板法、可见光法、TBA法检测HaCaT细胞中GSH、CAT活性和MDA含量

细胞生长至对数期，以1×106个/孔将细胞接种至6孔板，于37℃，5% CO2培养箱培养。6孔板细胞培养24 h后，随机分为空白组、UVB组、（10-7、10-6、10-5 mol/L）甘草苷+UVB组。吸弃培养液，PBS洗2次，每孔加1 mL PBS，空白组使用铝箔纸覆盖，用30 mJ/cm2 UVB照射UVB组和甘草苷+UVB组，照射完毕，吸弃PBS，UVB组加2 mL培养液，甘草苷+UVB组分别加入2 mL的0-7、10-6、10-5 mol/L的甘草苷药液，于37℃，5%CO2培养箱培养。待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中各组细胞，PBS洗2次，RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF以99∶1混匀，按照100 μL/孔加入混合液，冰盒上静置30 min，4℃，13 200 r/min的条件下离心15 min，在冰盒上收集上清液于离心管中，按照试剂盒说明书分别用微板法、可见光法、TBA法检测各组细胞中GSH、CAT活性和MDA含量。

1.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测HaCaT细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达量

参照“1.5”培养6孔板细胞。待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中细胞，使用RIPA和PMSF混合液提取蛋白，BCA法测定细胞蛋白浓度，上样缓冲液和蛋白样品以1∶4的比例混匀，煮沸10 min。根据蛋白浓度计算上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳60 min，半干转膜30 min，室温封闭2 h，加入一抗孵育，4℃过夜，TBST洗膜3次，加二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL显色，使用发光成像仪拍摄，利用Lane ID凝胶软件分析各条带的灰度值，以目的条带灰度值和内参条带灰度值的比值，反映目的蛋白的表达水平。endprint

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草苷安全有效浓度

与空白组相比，10-10、10-9 、10-8 mol/L甘草苷可明显促进细胞增殖（P < 0.01）；10-4、10-3 mol/L甘草苷可明显抑制细胞增殖（P < 0.01）；10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷组细胞增殖率差异无统计意义（P > 0.05），对细胞无明显的促增殖与抑制作用。因此，本实验选择10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷用于后续实验研究。见表1。

2.2 甘草苷对光老化HaCaT细胞增殖率的影响

与空白组相比，UVB组细胞增殖率显著降低（P < 0.01）；与UVB组相比，10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷+UVB組细胞增殖率显著升高（P < 0.01）。见表2。

2.3 HaCaT细胞中GSH、CAT活性和MDA含量

与空白组相比，UVB组GSH、CAT活性显著降低，MDA含量显著升高（P < 0.01）；与UVB组相比，甘草苷+UVB组GSH、CAT活性明显上升，MDA含量显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

2.4 HaCaT细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达量

与空白组相比，UVB组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量显著升高（P < 0.01）；与UVB组相比，10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷+UVB组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表4、图1。

3 讨论

人体皮肤长期暴露于紫外线下，可引起表皮微环境的改变，主要表现在众多细胞因子的释放[6]。角质细胞占据人皮肤表皮细胞的90%[7]，具有分泌细胞因子的功能，可通过释放细胞因子间接地影响机体的免疫功能[8]。UV辐射引起的氧化应激可促使体内产生大量的过氧化物[9]，当堆积于体内的过氧化物超过机体正常清除自由基的能力时，将会对机体造成破坏性的反应[10]，机体内氧化与抗氧化系统达不到动态平衡，从而使组织器官的机能逐步退化，机体表现出现衰老现象[11]。UV作用于HaCaT细胞，可激活转录因子NF-κB，导致多种炎性因子如IL-1、IL-6、IL-8以及TNF-α等的产生[12]。机体发生炎性反应时，TNF-α是出现最早的起关键作用的炎性因子，它能刺激淋巴细胞及中性粒细胞，增加血管内皮细胞的通透性，并诱导其他炎性因子的合成和释放[13]。IL-1β是具有免疫调节和执行宿主防御功能的炎性因子[14]，它可与与细胞表面的受体结合，激活转录信号级联系统，导致大量细胞因子、黏附分子和趋化因子的产生[15]。此外，IL-1β可通过激活转录因子NF-κB和激活蛋白AP-1，诱导皮肤炎症相关基因的转录，促进MMP-1的产生[16]，诱导皮肤光老化，此过程又可经过逆向调控相关细胞因子的基因表达，引发炎性反应和组织损伤[17]。IL -6是炎性反应过程中的重要促发剂，可促进T细胞的增殖和分化，刺激B细胞分化合产生抗体，参与机体的免疫应答[18]。IL-6还可通过自分泌机制促进基质金属蛋白酶1（MMP-1）的表达，加速细胞外基质的降解，诱导皮肤光老化[19]。陶冶等[20]实验研究证实，UVB照射可促进HaCaT细胞分泌炎性因子IL-1β和IL-6，间接导致皮肤光老化。UV辐射引发的TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的聚集，不仅可以导致局部炎性反应、组织水肿及通透性增加等[21]，还可通过正反馈作用促使NF-κB效应进一步放大，增强UV辐射效应，形成一个恶性循环[22]。本实验研究结果显示，UVB作用于细胞后，GSH、CAT活性显著降低，MDA含量显著增加，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量显著升高，说明UVB可降低机体内氧化酶活性，促使炎性因子的分泌，从而造成氧化损伤。而加入甘草苷药物干预后，GSH、CAT活性显著升高，MDA含量显著降低，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量显著降低，提示甘草苷可以升高氧化酶活性，减少炎性因子的产生，进一步减轻UVB对细胞造成的氧化损伤，抑制皮肤光老化。

综上所述，甘草苷可通过提高抗氧化酶活性和抑制炎性因子的产生，减轻氧化损伤，从而抵抗UVB对人皮肤造成的光损伤。但甘草苷是否能通过其他方式抑制人皮肤角质形成细胞光老化，有待进一步研究。

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（收稿日期：2017-09-25 本文编辑：李岳泽）endprint