转染携带Ifi204基因的慢病毒上调大鼠主动脉成纤维细胞的p204表达

胡 慧，吴 强，田茂波

(1.贵州省六盘水市人民医院 老年病科， 贵州 六盘水 553001； 2.贵州省人民医院 心血管内科， 贵州 贵阳 550002)

血管外膜成纤维细胞(vascular adventitial fibroblast,VAF)的激活、增殖、分泌细胞因子及合成细胞外基质异常是血管疾病的重要机制之一[1- 2]。干扰素(interferon,IFN)及其诱导表达的系列干扰素诱导蛋白(interferon-inducible protein，IFI)具有调控细胞增殖和凋亡的作用。IFIp204是p200家族中6个鼠类同源蛋白的成员之一，由Ifi204基因编码。α-干扰素可通过诱导p204表达抑制大鼠主动脉VAF增殖[3- 4]。本研究用携带Ifi204的慢病毒载体转染体外培养的大鼠主动脉VAF，观察转染效率和p204的表达，为p204表达变化对大鼠VAF生物学功能的影响及其在血管疾病中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级SD大鼠约4周龄，体质量110～130 g，雌雄不限[贵阳医学院实验动物中心，动物合格证号SCXK (黔)2012- 001]。细胞培养及纯化用的胎牛血清(Santa Cruz公司); DMEM高糖培养液、苏木精、二甲苯(Hyclone公司)；Pv- 9000二步法免疫组化验查试剂盒(北京中杉金桥公司)；含Ifi204的慢病毒颗粒(广州复能基因有限公司构建)；总RNA 提取试剂盒(Life公司)；q-PCR 2步法试剂盒(北京天根公司)。DRR420A 试剂盒(TaKaRa公司)。PCR引物(上海生工公司合成)；P204一抗(GeneTex公司)；通用二抗(Abmart公司)。GAPDH抗体(碧云天生物技术研究所)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VAF的培养、纯化及鉴定：按文献[5]介绍的植块贴壁法培养大鼠原代VAF。观察细胞增殖至80%汇合度时进行首次传代，应用差速贴壁法纯化VAF。用2 ～ 4 代细胞悬液制备细胞爬片，待细胞汇合度达50%～80%时，用多聚甲醛固定，PBS漂洗，PV- 9000染色，DABI工作液显色，苏木精复染细胞核15～30 s。配制梯度乙醇，乙醇浓度(%)依次为50、75、90和100，细胞分别放置时间为5、5、5和10 min脱水。二甲苯中透明细胞5 min，最后在倒置相差显微镜下观察拍照。

1.2.2 实验分组：实验分3组：携带Ifi204基因的慢病毒载体系统转染体外培养的大鼠VAF作为Ifi204组，空载慢病毒处理的VAF作为对照组(C组)，未处理的VAF作为空白组(N组)。

1.2.3 慢病毒转染：用逐孔稀释法测定、复核慢病毒滴度。设置MOI=0、10、20、40、60、80和100共7组，根据转染的细胞数，准确计算慢病毒量，使用移液器吸取准确体积的病毒液，尽可能保证所获得的含有慢病毒或携带Ifi204的慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。按5×104个/孔接种对数增殖期的VAF于两个6孔培养板，铺板时细胞汇合度约为50%，进行慢病毒转染时细胞汇合度约为70%。吸取含慢病毒及携带Ifi204慢病毒的DMEM，分别加入上述6孔培养板，放入5% CO2，37 ℃培养箱中孵育，分别于24、48和72 h观察细胞增殖状态及转染情况，如细胞增殖状态良好，可于72 h加入嘌呤霉素继续孵育，于第5天在倒置相差荧光显微镜下观察细胞增殖状态，检查感染效率，筛选细胞拍照并选取最佳MOI值。

1.2.4 q-PCR法检测p204的 mRNA表达：按Trizol总RNA提取试剂盒操作说明书提取细胞总RNA，用核酸蛋白分析仪测定总RNA纯度和浓度。取1 μg的RNA按q-PCR两步法试剂盒说明书反转录合成cDNA，取A260/A280比值为1.8～2.0的RNA进行q-PCR。按DRR420A试剂盒说明书操作扩增PCR。反应条件：预变性90 ℃ 40 s，变性95 ℃ 5 s，退火、延伸50 ℃ 30 s，共经40个循环。PCR引物序列(表1)。按2-ΔΔCt法计算3组p204 mRNA的丰度。

表1 p204和内参引物序列Table 1 Sequence of primers and p204

1.2.5 Western blot检测p204蛋白表达:提取各组细胞的总蛋白。用酶标仪于570 nm波长处测吸光度值，制作标准曲线。根据吸光度值与标准曲线进行蛋白定量。制胶、电泳分离蛋白，转膜后封闭，一抗、二抗孵育，将与分离胶大小相当的NC膜在暗室中进行曝光、显影、定影，以胶片透明为止，扫描胶片结果，用WCJF Image J软件分析各条带灰度与管家蛋白tubulin灰度的比值，据比值分析3组p204蛋白表达的差异。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 培养的VAF形态及免疫细胞化学鉴定

VAF贴壁后呈菱形或长梭形多层排列，部分交织成网状，高低起伏，细胞立体感和折光性强(图1A)。经vimentin蛋白免疫印迹，阳性细胞轮廓清楚，胞质着棕黄色，核清晰可见，背景清晰无特异性着色，阳性率达90%以上(图1B)。

2.2 携带Ifi204基因的慢病毒转染大鼠成纤维细胞后荧光质控转染效率

转染复数MOI=80时，转染效率相对较高，细胞状态较好。转染后48和72 h在荧光显微镜下观察转染效率分别为70%和80%。于第5天在荧光显微镜下观察仍可见75%左右的大鼠成纤维细胞内出现绿色荧光(图2)。

2.3 干扰素诱导蛋白p204的 mRNA表达

与N 组及C组比较，Ifi204组的p204 mRNA表达增加(P<0. 01)(图3)。

2.4 干扰素诱导蛋白p204蛋白水平的变化

干扰素诱导蛋白p204在Ifi204组、N组和C组均存在一定丰度的结构表达，与N 组及C组比较，Ifi204组的p204 蛋白表达增加(P<0. 01)(图4)。

A.light microscopy features of VAFs(× 200); B.VAFs was identified by immunocytochemistry(×100)图1 采用植块贴壁法培养的大鼠主动脉VAF的光镜特征和鉴定

图2 慢病毒介导Ifi204基因转染大鼠成纤维细胞荧光质控转染效率Fig 2 Translatlion efficient of Ifi204 gene was mediated by lentivirus(×100)

*P<0.01 compared with C and N group图3 p204 mRNA的相对表达量Fig 3 Expression of p204 mRNA

*P<0.01 compared with C and N group图4 p204 蛋白的相对表达量Fig 4 Expression of p204 protein(±s, n=4)

3 讨论

IFN与细胞膜受体结合后触发JAK/STAT信号传导通路[6]，在干扰素调节因子的协同作用下，诱导产生一系列IFI，从而发挥其众多生物学效应。干扰素诱导蛋白p200家族[7]是新近发现的一类IFI，其成员IFI16具有抑制人脑血管成纤维细胞增殖、迁移及新生血管形成的作用[8]，参与对血管内皮炎性因子的诱导。血管修复和内膜增生的过程在不同物种(小鼠、猪和人)和不同动脉(肱动脉、髂动脉、股动脉及主动脉)是类似的[9]。p200家族真正意义上的鼠/人之间(跨物种)的同源基因尚未发现[10]。p204可看作为“人的IFI 16”，因为它们都含有PAAD/DAPIN/Pyrin结构域(氨基酸序列相似度为51%)和一对200 X序列(相似度为51.3%)。提示促进p204的表达可能也参与调控血管壁各种细胞的增殖、迁移及新生血管的形成。其机制与p204延缓细胞G0/G1期进入S期[11 ]、抑制细胞周期G2/M转换[12]、抑制rRNA的合成有关。p204的诱导表达还是工作心肌细胞、骨骼肌肌管、成骨细胞、软骨细胞及巨噬细胞等多种组织及细胞分化的关键步骤。但在不同品系的大鼠中，IFNs对p204的诱导效率并不相同，提示p204表达不受内源性IFN的影响[13]。

病毒介导是生物介导转染方式之一，本研究探索出一套慢病毒载体介导Ifi204基因转染VAF的技术，其转染效率高和表达持久。证实了通过转染携带Ifi204基因的慢病毒可诱导p204在鼠血管VAF 过表达，为进一步探讨Ifi204基因过表达后对VAF增殖、凋亡与迁移的影响及分子机制的研究作铺垫，为p204通过慢病毒转染方式应用于血管增殖疾病的研究奠定了实验基础，具有广阔应用前景。

[1] Strauss BH, Rabinovitch M. Adventitial fibroblasts: defining a role in vessel wall remodeling[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, 22:1- 3.

[2] Chiang HY, Korshunov VA, Serour A,etal. Fibronectin is an important regulator of flow-induced vascular remodeling[J]. Arterioscler Thromb Vasc Bio,2009, 29:1074- 1079.

[3] 宋方,吴强,谭洪文,等.IFIα通过p204抑制大鼠主动脉外膜成纤维细胞增殖[J].基础医学与临床,2012,32:1431- 1436.

[4] Asefa B, Klarmann KD, Copeland NG,etal. The interferon-inducible p200 family of proteins: a perspective on their roles in cell cycle regulation and differentiation[J]. Blood Cells Mol Dis, 2004, 32: 155- 167.

[5] 宋方,吴强,陆德琴,等.一套系统培养鼠主动脉血管壁细胞简单可靠的方法[J].中国动脉硬化杂志,2011,19: 361- 366.

[6] Gough DJ, Levy DE, Johnstone RW,etal. IFN gamma signaling-does it mean JAK-STAT? [J].Cytokine Growth Factor Rev, 2008, 19: 383- 394.

[7] Luan Y, Lengyel P, Liu CJ. p204, a p200 family protein, as a multifunctional regulator of cell proliferation and differentiation[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2008, 19: 357- 369.

[8] Raffaella R, Gioia D, De Andrea M,etal. The inter-feron-inducible IFI16 gene inhibits tube morphogenesis and proliferation of primary, but not HPV16 E6/E7-immortalized human endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 2004, 293: 331- 345.

[9] Harvat BL,Jetten AM. Gamma-interferon induces an irreversible growth arrest inmid.G1 in mammary epithelial cells which correlates with a block in hyperphosphorylation of retinoblastoma[J]. Cell Growth,1996, 7:289- 300.

[10] Garcia-Sastre A, Biron CA.Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente[J]. Science, 2006,312:879- 882.

[11] 韩清见,张耀洲.心脏干/祖细胞研究进展[J]. 细胞生物学杂志, 2008,30: 317- 322.

[12] Asefa B, Dermott JM, Kaldis P,etal. p205, a potential tumor suppressor, inhibits cell proliferation via multiple pathways of cell cycle regulation[J]. FEBS Lett, 2006,580: 1205- 1214.

[13] Seelig HP, Ehrfeld H, Renz M. Interferon-gamma-inducible protein p16. A new target of antinuclear antibodies in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum, 1994,37: 1672- 1683.