梨树PyS6PDH2基因的克隆及其在不同树形条件下的表达分析

刘政+林世华+安莉园+秦仲麒+伍涛+李先明+涂俊凡+杨夫臣+朱红艳+杨立

摘要：山梨醇是梨树等蔷薇科植物光合作用初级转运产物。6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH）是山梨醇合成过程中的关键酶，但是其在不同树形中的调控作用尚未阐明。结果表明，PyS6PDH2基因包含933 bp的开放读码框，编码310个氨基酸，分子质量为34.9 ku，理论等电点为8.73，具有亲水性。PyS6PDH2的氨基酸序列与其他蔷薇科植物的S6PDH具有高度的同源性。PyS6PDH2蛋白质二级结构元件包括α-螺旋（42.58%）、β-转角（9.03%）、延伸链（18.39%），和不规则盘绕（30.00%）。表达分析表明PyS6PDH2基因在棚架树形叶中的表达水平高于疏散分层形，该基因可能是通过促进山梨醇合成从而提高棚架树形的果实品质。

关键词：梨树；PyS6PDH2基因；山梨醇合成；树形；克隆；qRT-PCR

中图分类号：Q78；S661.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4902-05

目前中国梨生产面积基本已稳定在112万hm2左右，产量达到1 869.9万t。然而现存的老梨园多采用传统的多主枝疏散分层形，其树体高大，枝量重叠，树冠郁闭，病虫害问题严重。随着中国劳动力成本不断攀升以及老龄化问题日渐凸显，许多果园精细化管理水平得不到有效保证，制约了优质果品的生产[1]。因此，发展轻简化、优质高产整形模式是果园栽培管理的必然趋势。

光照条件是决定果实品质和产量最重要的关键因素之一[2]。良好的树形结构可以提高光合有效辐射（Photosynthetically active radiation，PAR）在冠层内的渗透和分布，促进光合作用合成产物更有效地从叶（源）向果实（库）积累，从而提升果实产量和品质[3-5]。此外，整形不仅能够调节冠层微气候，通风透光，降低相对湿度，减少病害的发生率[6]，还能够促进花芽分化，影响叶蒸腾作用，增加果实糖分、花青素以及总酚含量[7]。为了明确整形模式对果实品质的影响，Asadollsh等[8]对5种树形条件下的“Golden Delicious”苹果树营养生长（树高度、新稍生长量、主干直径、树冠扩张量）和果实品质（大小、单果重、硬度、风味、芳香、可溶性固形物、可滴定酸、产量）进行了比较，发现不同的树体结构明显影响了果实品质，且细长纺锤形果实产量最高；Pasa等[9]分析了桃的3种树形，发现“中心领导干”树形在早期产量和经济回报上高于其他两种树形。

梨树传统的树形多样，包括疏散分层形、开心形、自然圆头形、Y字形等。近几年来，梨棚架栽培模式由于操作管理方便，便于标准化和机械化生产而被广泛推广，其光照和通风条件好被认为是果实单果质量高、商品性好的原因[10]。目前本课题组以及国内外同行已从生理水平的角度比较了不同树形对梨光合作用和果实产量及品质的影响[1，11-14]，然而梨树树形调控果实品质的相关基因研究尚未报道。分离并克隆树形调控光合产物积累的关键基因，有望为解析其调控机理提供理论支持。

山梨醇是梨等多种蔷薇科木本植物最主要的光合产物，也是向果实运输最重要的碳水化合物运输形式和储藏物质，并与改善果实风味密切相关[15，16]。6-磷酸山梨醇脱氢酶（Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase，S6PDH；EC 1.1.1.200）在山梨醇合成过程中起着催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸山梨醇的作用，其活性伴随着山梨醇的积累并且在叶片中有较高的表达[17]。研究者在苹果叶片中克隆了S6PDH基因，发现该基因在子叶中的活性高于其他器官[18，19]。完全成熟的桃叶片中S6PDH基因表达水平以及其的酶活性和蛋白水平均高于幼嫩叶片，表明该基因的表达与叶片源强密切相关[20]。Kim等[21]克隆出了编码310个氨基酸序列的PyS6PDH基因，其在花后30 d的梨叶片组织高表达，并在之后的时期呈现有波动的下降表达；高温对PyS6PDH基因表达水平在梨叶中有抑制作用，但是其在果实中表达没有明顯的影响[22]；提高钾含量能明显提高梨叶片和果实的山梨醇及S6PDH基因表达水平[23]。

梨基因组测序工作的完成（http：//peargenome.njau.edu.cn/）能迅速功能基因的挖掘[24]。本研究利用基因组序列信息，克隆出了一个新的S6PDH基因，并对该基因进行了序列分析，采用qRT-PCR技术分析其在不同树形的叶片组织中的表达模式差异，为进一步解析该基因在整形模式调控光合产物积累过程中的作用提供分子水平上的证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016年在湖北省农业科学院果树茶叶研究所金水基地梨育种试验园进行。供试材料为八年生的疏散分层形和“双臂顺行式”棚架树形的圆黄梨（Pyrus pyrifolia Nakai. cv. Wonhwang）叶片，两种树形的梨树树势相似，施肥、灌溉、病虫防治等管理水平相对一致。取样方法参照王少敏等[25]，每株树从各方向选择中上部生长一致的枝梢，从顶部下数第5～7片完全展开的功能叶混合成1个样本池。分别在花后50、80、110、140 d取样，立即放入液氮速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱。

1.2 总RNA提取、检测与cDNA合成

采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Tiangen，China）提取各样本的总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳和NanoPhotometerTM Spectrophotometer（IMPLEN，Germany）评价RNA的完整性并检测其浓度。以总RNA为模板，使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，USA）进行cDNA第一链的合成。

1.3 基因的克隆与序列分析endprint