草鱼养殖池噬菌蛭弧菌的分离与鉴定

陈煜安

摘要：利用双层平板法，以嗜水气胞菌（Aeromonas hydrophila）为宿主菌，从草鱼养殖池水中分离蛭弧菌一株；根据蛭弧菌hit基因序列设计引物进行PCR扩增，所得产物经胶回收、测序比对，发现其序列与噬菌蛭弧菌的hit基因100%同源，表明所分离得到的为噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）。

关键词：噬菌蛭弧菌；分离；鉴定；PCR

中图分类号：S943 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4737-03

噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）是一类由Stolp等[1]于1962年首次发现的、原核生物界惟一一类周质型专性捕食性细菌。其体形小，在土壤、淡海水、污水等不同生境中分布广泛，且运动活泼，具有“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主菌的生物学特性[2-4]。

近年来，随着集约化水产养殖业的进一步发展及养殖水体的污染，嗜水气单胞菌等革兰氏阴性病原菌对草鱼等水产养殖动物造成了严重的危害[5-7]。蛭弧菌能寄生和裂解大多数种类的革兰阴性菌。鉴于这一特性，噬菌蛭弧菌受到了国内外学者的广泛关注，逐渐成为水产养殖业中一种良好的微生态制剂，在农业、工业和医学等不同领域均显示出广阔的应用前景[8-12]。

本研究利用雙层平板法从草鱼养殖池水中分离得到蛭弧菌一株，根据噬菌斑形成等对其进行初步的鉴定，同时根据蛭弧菌的Host interaction（hit）基因序列设计了特异性引物[13，14]，从分子水平上对该菌株进行鉴定，以期为该菌应用于水产养殖疾病防治等理论研究与实践应用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水样 采自绍兴皋埠镇某草鱼养殖池，用采水器从底部取水，装于50 mL灭菌的离心管中。

1.1.2 宿主菌株 以绍兴鲁迅中学实验室分离自患病草鱼并保存的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为宿主菌。

1.1.3 培养基 双层培养基：上层为0.6%自来水琼脂，用于蛭弧菌筛选、分离和纯化；下层为1.5%自来水琼脂；普通营养肉汤培养基（NB）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠15 g，琼脂1.5 g，无菌水加至1 000 mL，pH 7.0；浸出液（NB液体培养基）：上述普通营养肉汤培养基不添加琼脂。

1.1.4 主要试剂 Taq酶、dNTPs购自生物工程（上海）股份有限公司产品；DNA回收试剂盒购自爱思进公司；pGMT载体、大肠杆菌感受态等均购自天根公司；其他为国产分析纯。

1.2 噬菌蛭弧菌的分离与鉴定

1.2.1 宿主菌悬液的制备 将宿主菌嗜水气单胞菌接种于NB平板上，30 ℃过夜培养，刮取、无菌水洗脱细菌并收集于5 mL离心管中，10 000 r/min，室温离心2 min，去上清液，加入3 mL无菌水制备成菌悬液，4 ℃保存备用。

1.2.2 蛭弧菌的分离与纯化 样品处理：取池水，经8层纱布过滤，得澄清液置超速冷冻离心机中离心（4 ℃，30 000 r/min，40 min）；沉淀用5 mL无菌水溶解，再经0.22 μm滤膜过滤后备用。

蛭弧菌的分离、纯化：取1 mL滤液加入2 mL的宿主菌悬液，混匀；然后加入0.6%自来水琼脂培养基共7 mL（灭菌并保持在48 ℃左右），摇匀后倒置在经灭菌的1.5%自来水琼脂固体培养基上。30 ℃下倒置培养，观察噬菌斑的形成；经2～4 d的培养，刮取平板上透明、圆形和整齐的单个噬菌斑，置于NB液体培养基的离心管中，浸泡10 min以上；用浸出液做双层平板，重复传代3次以上获得纯化的蛭弧菌。

1.2.3 蛭弧菌的PCR鉴定 在结合以上噬菌斑进行鉴定的基础上，根据文献报道[13，14]及GenBank中蛭弧菌hit基因的序列，利用Oligo 6.5软件设计特异性引物，BDhitf：5′-GTGGCTTCAAACGGAGTGGA-3′，BDhitr：5′-ACGACTGTGAACGGCAACG-3′。PCR扩增体系：DNA模板（噬菌斑浸出液）2.0 μL，Taq酶0.2 μL，dNTPs 0.4 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，引物各1.0 μL，无菌水17.9 μL。循环参数：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，PCR产物经割胶回收后，与T载体连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；阳性克隆经鉴定后送生物工程（上海）股份有限公司测序，用Blast和Clustal W2软件进行序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 蛭弧菌的分离结果

采用双层琼脂平板法，以嗜水气单胞菌为宿主菌，通过滤膜过滤的方法收集草鱼养殖池池水培养蛭弧菌。结果如图1所示，从2 d时开始形成大小相似、直径约0.10～0.25 cm的圆形、透明、边缘整齐、凹陷的噬菌斑“负菌落”；3 d后出斑率较高，直至7 d左右，其大小总体上随培养时间延长而增大，显示所分离的蛭弧菌具有明显的噬菌作用。挑选特征典型的噬菌斑进行传代，经4次传代后得到蛭弧菌一株，命名为BD-sx1（图1）。

2.2 蛭弧菌的PCR鉴定

在利用噬菌斑等形态学指标和噬菌特性对分离到的蛭弧菌进行初步观察与鉴定的基础上，以宿主嗜水气单胞菌和大肠杆菌DH5α为阴性对照，进行PCR扩增反应。结果（图2）显示，只有蛭弧菌菌株BD-sx1中获得近800 bp的扩增条带，大小与预期相符。进而对PCR扩增产物进行割胶回收，纯化产物与T载体连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α感受态细胞，对经鉴定后的阳性克隆进行测序，经Blast和Clustal W2软件与GenBank中已知的蛭弧菌hit基因序列比对分析，结果表明，所得基因序列与噬菌蛭弧菌的hit基因序列100%相似（图3），进一步证明本研究所分离、纯化到的蛭弧菌菌株BD-sx1为噬菌蛭弧菌。endprint