HPLC法测定六味地黄膏中莫诺苷和马钱苷含量

★ 林雨芹季巧遇邵坚 吴样明 周海萍 黄茜

(1.江西中医药大学 南昌 330004；2.江中药业股份有限公司 南昌330096)

六味地黄膏由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻等六味药材组成，具有滋阴补肾之功效。膏滋药历史悠久，其效以滋补为主，兼有缓和的治疗作用，尤其适合慢性病患者及年老体弱者调养之用。六味地黄膏现行标准收载于《卫生部药品标准》[1]WS3-B-2489-97，其质量标准已严重落后于现有六味地黄其他制剂。本文参照《中国药典》[2]2015版一部中六味地黄制剂质量标准及相关文献报道[3-5]，采用高效液相色谱法测定六味地黄膏中莫诺苷和马钱苷的含量，并进行了方法学验证，表明该方法简便易行，结果准确可靠，可用于六味地黄膏的质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；科昌达超声波清洗器(南昌科昌达超声波仪器厂)；CPA 225型电子天平(赛多利斯)；AB204-N 型分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

1.2 材料 六味地黄膏3批(江中药业，批号2015080001、2015080002、2015080003)；莫诺苷对照品(中国食品药品检定研究院111998-201501)；马钱苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111640-201606)；乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取莫诺苷、马钱苷适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含20μg的溶液，作为混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取六味地黄膏1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25mL，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

缺酒萸肉阴性对照溶液的制备：取缺酒萸肉阴性对照样品1g，按供试品溶液制备方法同法制备缺酒萸肉阴性对照溶液。

2.3 色谱条件与系统适应性 色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6mm×150 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)；梯度洗脱(0～7min，5%～8% A；7～20min，8% A；20～35min，8%～20% A；35～45min，20%～80% A)；检测波长为240 nm；柱温为40 ℃；流速为1.0mL/min；进样量为10 μL。理论塔板数不低于4000，在该色谱条件下莫诺苷和马钱苷与其他组分之间分离度良好(R>1.5)。

阴性干扰试验：取混合对照品溶液、供试品溶液和缺酒萸肉阴性对照溶液，分别进样10 μL，结果表明阴性无干扰，该法专属性较强，见图1。

2.4 线性关系考察 精密称取莫诺苷对照品10.95 mg及马钱苷对照品10.70 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解稀释至刻度，制成每1 mL含0.438 mg莫诺苷及0.428 mg马钱苷的混合对照品母液。等梯度稀释混合对照品母液，即得混合对照品溶液(莫诺苷依次为浓度5.5，11.0，21.9，43.8，87.6μg/mL，马钱苷浓度依次为5.4，10.7，21.4，42.8，85.6μg/mL)。

精密吸取各浓度的混合对照品溶液10 μL，分别注入高效液相色谱仪，按2.3项下色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。得莫诺苷及马钱苷的回归方程分别为Y=16.5025X-7.1242(r=0.9999)，Y=15.7320X-1.9777(r=0.9999)。结果表明莫诺苷及马钱苷分别在5.5～87.6μg/mL、5.4～85.6μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取莫诺苷浓度为21.9μg/mL，马钱苷浓度为21.4μg/mL的混合对照品溶液10 μL，连续进样5次，依法测定，记录莫诺苷及马钱苷的峰面积，RSD值分别为0.77%，0.73%，结果表明仪器精密度良好。

A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；

C.阴性对照溶液；1.莫诺苷；2.马钱苷

图1 莫诺苷、马钱苷HPLC图谱

2.6 稳定性试验 取六味地黄膏约1 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样分析，记录莫诺苷及马钱苷的峰面积，其RSD值分别为2.49%，1.09%，表明供试品在24h内基本稳定。

2.7 重复性试验 取同一批次的六味地黄膏样品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定莫诺苷及马钱苷含量，莫诺苷及马钱苷的平均含量分别为0.6448mg/g、0.4691mg/g，RSD值分别为0.98%、1.94%，结果表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的六味地黄膏(莫诺苷含量为0.6448 mg/g，马钱苷含量为0.4691 mg/g)0.5g(6份)，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液(莫诺苷浓度为0.3066 mg/mL，马钱苷浓度为0.2996 mg/mL)1.0 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法测定莫诺苷及马钱苷的含量，计算该方法的回收率。结果六味地黄膏中莫诺苷及马钱苷的平均回收率分别为96.7%，91.02%，RSD值分别为1.67%，1.81%，结果表明该方法加样回收率较好。结果见表1-2。

表1 莫诺苷加样回收率试验结果

表2 马钱苷加样回收率试验结果

2.9 样品测定 取三批六味地黄膏样品，依法制备并测定，结果见表3。

表3 样品测定结果 mg/g

根据药材含量和三批样品含测数据，初步暂定产品的含测限度为本品每克含莫诺苷和马钱苷含量总和应不低于0.30 mg。

3 讨论

(1)本文建立的含测方法经方法学验证，表明方法方法简便易行，结果准确可靠，为六味地黄膏的质量控制提供了参考依据。

(2)本试验还优化了流动相梯度洗脱条件，使各峰得到较好的分离。

(3)本试验考察了超声提取及回流提取两种方法制备供试品，结果表明回流提取提取率优于超声提取，故选择回流提取制备供试品溶液。

(4)本文根据药材含量和三批样品含测数据，初步暂定产品的含测限度为本品每克含莫诺苷和马钱苷含量总和应不低于0.30mg。

[1]国家药典委员会.卫生部药品标准·中药成方制剂第十三册[S].北京:人民卫生出版社,1997:44.

[2]国家药典委员会.中国药典·一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:705-706.

[3]杨明明,袁晓旭,赵桂琴,等.山茱萸化学成分和药理作用的研究进展[J].承德医学院学报,2016,33(5):398-400.

[4]李观林.山茱萸中环烯醚萜苷类的研究进展[J].亚太传统医药,2014,10(18):48-49.

[5]吴红,梁恒,刘永红,等. 山茱萸总皂苷的提取分离与含量测定[J].第四军医大学学报,2003,24(5):430-432.