猪细小病毒检测方法的研究综述

刘胜利 ，吕玉金 ，李文刚 ＊

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.河南牧业经济学院动物医学院）

猪细小病毒病（PPI）是由猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍病，主要特征为母猪发生流产、死胎、木乃伊胎及不育、早期胚胎死亡和新生仔猪大量死亡等，也可引起仔猪腹泻、皮炎及关节炎等。此病发生时，病变主要体现在胎儿，常见的有：胎儿水肿、充血、出血、体腔积液、脱水（木乃伊化）及坏死等病变，而母猪则无明显临床症状。

随着行业的发展，养殖规模化、密集型程度越来越高，猪群的跨区域流通机会也越来越多，加快了猪细小病毒病的传播，且出现了多病混合感染的现象。从1966年首次发现该病分离出病毒后，到目前为止，世界各国均有流行和报道，常现多种病原混合感染，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前国内外有多种检测方式，如血清学检测、分子生物学检测等。其中血清学检测较为常用，但分子生物学检测更为准确、快速，并可同时检测多种疾病。

1 传统的检测方法

猪细小病毒病可根据其流行病学、临床症状以及剖检症状，做出初步诊断，但确诊仍需借助病毒分离、鉴定等实验室诊断方法。此方法费时费力，而且还需要特定的设备和技术。

在进行病毒的分离与鉴定时，取疑似感染猪细小病毒（PPV）的病料，将病料加双抗研磨成乳浊液，离心后取上清液，接种于PK-15细胞或ST细胞分离培养。接毒2～3 d后，细胞出现病变，收获病毒，电镜观察。此方法直接、准确、有效，但耗时较长，不能满足传染病疫情防治工作的需要，不利于基层单位的使用。

2 血清学检测方法

2.1 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

HA和HI试验是最简单、最常用的检测猪细小病毒的血清学检测方法。PPV能凝集人、猴、猫、鸡、豚鼠、大鼠和小鼠的红细胞，一般实验室常用豚鼠红细胞作为凝集细胞。该方法简单方便、易行，且能进行快速、大量的样品检测，因此应用普遍。HI试验是检测抗体的最常用的方法:将待检血清灭活处理后，用红细胞吸附，除去血清中的非特异性血凝素，用高岭土吸附来除去或减少非抗体性抑制因子。该方法较简便、灵敏度也较高；但所需红细胞需现用现配，被检血清的处理也较为繁琐。

2.2 中和试验

中和试验也是常用的检测PPV抗体的方法。其用PPV与被检血清的抗体进行中和，根据培养细胞的病变状况来计算血清抗体的滴度。中和试验的特异性较高，但操作较复杂，完成一次试验常需一周或更长的时间，不适于临床诊断，并且该方法需要水准较高的细胞培养技术和病变结果判定技术等专业技术，一般实验室不采用。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是一种将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来的用于检测的应用型技术，既可用于检测抗原，又可用于检测抗体。Hohdalsu等建立了猪细小病毒的ELISA诊断技术，敏感性显著高于HI的检测结果。ELISA检测方法具有特异性强和敏感度高、操作简单、检测快速、高通量等优点，特别适用于基层兽医部门及大面积疫病普查。田莉莉等建立了检测猪细小病毒的抗原捕捉ELISA方法（AC-ELISA）用来制备猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体（McAb）。该方法与RT-PCR相比较，符合率较高，有良好的特异性、敏感性和重复性，可应用于猪细小病毒感染的早期诊断。

3 分子生物学检测方法

3.1 PCR检测技术

PCR技术是1985年的美国一公司人类遗传研究室发明的体外扩增特异DNA片段的一种技术。PCR检测方法是将PCR技术与电泳技术相结合，该方法特异性强、敏感性高、易操作、耗时短，已成为临床检测PPV的首选方法（但存在假阳性和PCR污染等弊端）。Moliter等最先报道了PCR在检测PPV上的应用。

3.2 多重PCR诊断检测技术

多重PCR诊断方法是普通PCR的改良版，是将多对特异性引物加入同一个PCR反应体系中，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR诊断技术。因为多重PCR能够在一个PCR反应管中同时扩增多个目的片段，因此，既有普通PCR的优点，又能节约大量的时间、人力和物力等，它能快速、准确地诊断疾病，适用于大量临床样品（特别是混合感染样品）中病原体的快速诊断。Huang C等建立了多重PCR技术用于PRV、PPV和PCV的诊断，该法能同时检测3种病毒的感染。在国内，李文刚、王汉中分别据VP1、VP2序列设计了nest-PCR引物，提高了检测的特异性和敏感性。

3.3 Taq Man荧光定量PCR检测方法

随着荧光定量PCR仪的普及，荧光定量PCR技术飞速发展，它将常规PCR技术与荧光检测相结合，用来检测临床病料中的各种病原。与普通PCR方法相比，荧光定量PCR特异性强、灵敏性高、用时短，而且有相应的分析软件对数据进行分析、整理，结果更为准确、直观。另外，实验过程中只需打开1次试管，有效地减少了假阳性的发生机会，已成为检测病原体的重要方法。探针法荧光PCR增加了探针结合的反应，进一步提高了其特异性。

3.4 SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法

SYBR GreenⅠ是一种具有绿色激发波长的染料，与PCR合成的双链DNA结合后，在激发光照射下能产生荧光，通过荧光强度的检测，可以实时监测PCR的产物量。SYBR GreenⅠ嵌合荧光简单，成本较低，并且反应后无需电泳检测，污染率低、反应时间短、准确性高，且不需要探针，使检测方法变得简便，成本较低，能满足诊断的要求。但荧光染料能和任何双链DNA结合，因此容易产生假阳性信号。

3.5 LAMP检测方法

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种可高效扩增核酸并广泛应用于疫病快速检测的一种新型检测方法。日本学者Notomi等发明了环介导等温扩增反应，其针对靶基因设计了2～3对特异引物（内引物、外引物和环引物，其中环引物为非必要引物），在Bst DNA poLymerase等温条件下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。LAMP作为一种新的核酸扩增技术，该检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、反应条件低、反应成本低和设备要求低等优势，适合用于临床PPV快速检测。

3.6 基因芯片检测技术

基因芯片技术是近年来新兴起的一种基因诊断技术，其原理是在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或者直接将探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，再检测分析杂交信号，最终得到样品的预定结果，基因芯片技术流程中尤以样品的固定和杂交的检测最为重要。该技术可以同时检测多种病毒，同步检测多个样品，其具有特异、敏感、快速、高效、可重复、平行化、自动化等特点，节约了疾病诊断时间，因而具有良好的实用性。1995年Schena发表了第一篇关于基因表达芯片的论文，从此以基因芯片为代表的生物芯片技术得到了迅猛发展，在生命科学领域发挥了重要作用。

3.7 可视化基因芯片检测

可视化芯片技术是在常规芯片基础上发展起来的一种技术类型，其在基因芯片技术基础上，将待检病原体的特异片段作为探针固定在芯片上，用标记有生物素的靶基因与之杂交，再加入纳米金标记的链霉亲和素，最后用硝酸银和对苯二酚混合液进行银染从而可以用肉眼或是简单的光学成像系统捕获信号。可视化生物芯片具有快速、可视、设备要求低等特点，近些年来被广泛应用于病原检测、基因突变检测及差异表达、酶功能研究等方面，具有巨大的潜在应用前景。

4 结语

综上所述，猪细小病毒的诊断方法很多，应用最多的是血清学检测技术，尤其是血凝和血凝抑制试验，但前者实验特异性、敏感度较低，在低滴度感染时难于检出，后者配置血清较麻烦。分子生物学诊断技术中，最常用的是普通PCR技术，但无法一次性检测多个样品，而多重PCR检测，荧光定量检测，LAMP检测，基因芯片等方法则具有高度的特异性、灵敏性，可检测大量样品，适应于多种病毒混合感染，且检测结果准确、可靠、快速，尤其是基因芯片技术具有高并行性、高通量的特点，可进行大批量的样品检测，但是，其所需的设备体积较大、价格昂贵、实验室环境要求高，普通实验室难以开展相关工作。可视化基因芯片是基因芯片技术的未来走向，它不需昂贵的荧光扫描设备，降低了成本，不受环境局限等，增加了生物芯片的使用范围，在临床应用方面将具有更好的发展前景，但目前做不到具备高质量和低价格的可视化基因芯片，因此无法推广，需打好基础，做出高质量的基因芯片。以上是各种检测方法的比较，各有优劣，可根据自身情况优化选择最适合的检测方法。□