基于PCR方法的牛分枝杆菌分子检测技术研究进展

李凡飞,何小丽,程 成,王文佳,张 凯,许立华

(宁夏大学农学院,宁夏 银川 750021)

世界卫生组织(Word Health Organization,WHO)已将牛结核病划入了7大重要的人兽共患病。结核病是一种人兽共患的慢性消耗性传染病,潜伏期较长。牛分枝杆菌(Mycobactrium bovis)是牛结核病的主要致病病原体,可以感染牛以及包括人在内的大部分哺乳动物[1],能够在环境中存活数月至1年。由于动物全球化和密集的贸易牲,结核病已经严重威胁了世界公共卫生,在2012年有大约860万新病例产生和130万例患者的死亡。近几年,有关部门对我国牛场牛结核病的流行病学进行调查,发现我国牛结核病的发病率一直呈现上升态势。解决这一现象前提是要有一个在牛结核病早期就能做出准确诊断的检测方法。提纯结核菌素(PPD)皮内接种试验是目前具有实际意义的诊断方法,但皮内反应缺乏特异性,而细菌学方法又耗时过长且培养检出率低、敏感性差[2];血清学诊断技术是一种快速简便的检查技术由于结核杆菌的抗原性较弱,且属间和种间共同抗原决定簇的存在及体液免疫与结核病的相关性未得到充分的阐明,血清学诊断技术难以取得实质性的进展[3]。所以这些方法已无法满足现代临床诊断的需要。通过对近几年牛分枝杆菌PCR检测技术进展作综述,总结出一个符合实际及合理的检测方法。

1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术

PCR技术是通过利用体外基因扩增方法,将少到几个拷贝病原微生物的DNA扩增到常规可检测水平,是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物技术。它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。研究表明,结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)成员拥有一个祖先,通过连续的DNA缺失/插入得到进化从而形成了目前的分枝杆菌。卡内蒂分枝杆菌(M.canettii)包含所有的RD、RvD和结核病D1区域,因此可以推测它可能是最接近其基因组细菌的祖先。缺乏RD9区域的非洲分枝杆菌(M.africanum)主要存在于西非地区,而该菌在东非地区则保存RD9但缺乏RD3。田鼠分支杆菌(M.microti)缺失的特异区域有RD7、RD8、RD9和RD10,进一步发现在一部分田鼠分枝杆菌中也会丢失了RD5;在西欧一些国家发现的牛分枝杆菌缺失(RD4～RD13)区域;山羊分枝杆菌(M.caprae)与牛分枝杆菌关系密切,但在gyrB基因上有几个核苷酸替换。所以可以通过14个差异区(RD1～RD14)在不同菌种上有不同的缺失区域来鉴别菌株种类[4]。而PCR检测的原理就是根据每个菌种所携带的基因区域各异而进行特异性检测。以下是实验室内3种常规PCR技术在牛分枝杆菌检测中的应用情况。

1.1 多重PCR(Multiplepolymerase chain reaction)多重PCR是在同一PCR反应体系里有2对以上的引物,结果同时可扩增出多个核酸片段的PCR技术。Luz[5]等人于1998年通过两个特殊基因序列pcnA和oxyR上的突变基因点,即pcnA上169位点胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的不同,oxyR上285位点胞嘧啶(C)与胸腺嘧啶(T)的不同,利用PCR技术将牛分枝杆菌和结核分枝杆菌区分。刘思国等[6]于2006年也同样根据特异的pcnA基因序列建立了牛分枝杆菌的PCR方法。他们以牛分枝杆菌培养阳性和阴性为参考,扩增的阳性符合率为90%,扩增的阴性符合率100%。PCR是一种简便、灵敏、快速(检测时间不到3 h)、特异的基因诊断技术,尤其对排菌少的机体可以做早期诊断如肺外结核的诊断具有重要意义。2012年乔宏胜[7]等构建了以3种分枝杆菌特异性片段为目的基因的多重PCR检测方法,3个特异序列分别为结核分枝杆菌RD10序列、牛分枝杆菌moaB序列、鸟分枝杆菌16～23S rDNA序列。该方法的最低检出量为103copies/μL的DNA模板,可用于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌的鉴别和牛结核病的快速检测。2013年张喜悦[8]等先将临床分离的菌株进行筛选,即通过MYCGEN和TB1基因检测来判断是否为结核分枝杆菌复合群,再对 16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv3877、Rv3120 基因进行引物设计和PCR扩增,最终通过扩增出的目的片段鉴别分离菌株的种类。2016年Zhang Quan[9]等设计出16S rRNA、Rv3873和12.7-kb基因的多重PCR。通过该方法可以鉴别出结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛卡介苗和非结核分枝杆菌。该方法从盲样中检测出牛结核病数量要少于γ-干扰素(INF-γ)诊断方法的检出量。该方法也可作为结核分枝杆菌复合群和非分枝杆菌鉴别的补充试验。多重PCR反应缺点是体系内多条引物扩增时会产生相互抑制,PCR副产物焦磷酸的产生也会抑制PCR反应。为克服多重PCR反应的不足,近年来新的PCR衍生技术不断发展,如逆转录PCR、巢式PCR等。

1.2 逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR) RT-PCR是以RNA为模板,先将RNA在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA,然后对cDNA进行PCR,使RNA在体外大量扩增。RT-PCR提供了一种基因表达、检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。因此,RT-PCR成为目前获得目的RNA的一种重要手段。近年基于原核RNA半衰期短(2～3 min)将mRNA与荧光定量PCR结合,建立特异、敏感、快速、可靠的活菌检测技术,通过评价特异性、灵敏度、重复性来区分细菌存活状态和检测临床样本的能力等,为牛分枝杆菌的快速检测提供新方法和新思路。2015年Y.choi[10]等以结核分枝杆菌复合群的16S rRNA作为目的基因增加了聚合酶链反应的灵敏度和特异性有利于牛结核病的诊断。在痰样本中16S rRNA逆转录PCR反应的灵敏度为94.6%。蔡龙等[11]用该技术检测3株结核分枝杆菌标准株在利福平、异烟肼处理24 h后85B mRNA表达水平的变化,结果显示,本方法与绝对浓度法有一致的检测结果。RT-PCR技术可用于快速检测牛分枝杆菌的药敏试验。但该方法的缺点是操作繁杂、质量控制要求高。但随着自动化仪器的开发以及方法学的进一步完善,它或将成为牛分枝杆菌药敏试验快速有效的检测方法。

1.3 巢式PCR(Nested-Polymerase Chain Reaction,NPCR) 巢式PCR是使用两条PCR引物扩增完整的片段,第1对PCR引物扩增片段和普通PCR相似,第2对是巢式引物,结合在第1次PCR产物内部,使第2次PCR扩增片段短于第1次扩增,这种巢式PCR特异性特别高。2001年M.C.[12]等使用单管套式PCR(One-tube nested-Polymerase Chain Reaction,OTN PCR)从奶样分离的菌样品中筛选出牛分枝杆菌;在牛奶,这个试验的最低检出量是20～50细胞/毫升。该方法在没有牛分枝杆菌细胞的样品中扩增不出特异性产物,这表明OTN PCR具有很高的特异性,PCR外部的引物用的是牛分枝杆菌特异性蛋白质抗原的基因。在我国,已经有人应用NPCR来检测结核分枝杆菌,但是,NPCR作为筛选技术或者诊断技术,还需要全面提高了PCR诊断能力,由于其缺乏一个有效的程序富集分枝杆菌,而影响检测的灵敏性。

2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)

实时定量PCR是一种新的核酸定量技术。该方法通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。染料法：在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan探针法：探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。样品处理液的实时荧光PCR为结核分枝杆菌复合群分离培养提供一个简捷的方法。实时荧光PCR能快速、精确地筛选出从患牛淋巴结上的牛分枝杆菌[13]。与“金标准”的细菌培养相比,传统PCR检出的阳性符合率为93%所消耗时间为9 h,而荧光定量PCR检出的阳性符合率为71%,所消耗时间仅为30 min[12]。因此荧光定量PCR技术将来对于牛结核病可能作为高通量分子诊断技术。对于结核分枝杆菌复合群成员的鉴定是至关重要的,这为及时正确地进行抗生素治疗以及公共卫生服务管理提供合理的措施。目前商用分子化验仅能鉴定分枝杆菌群,还无法区分结核分枝杆菌与其基因组相近的牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗。

2008 年Benjamin A.Pinsky[14]等基于基因组缺失建立多重实时荧光PCR鉴别出结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗和结核分枝杆菌复合群的其他菌株。2014年M.L.Sales[15]等建立了两个分别以PE-PGRS 20和RD4为目的基因的实时PCR来检测牛分枝杆菌和以PE-PGRS 20和RD4基因实时PCR,特异性分别为91%和100%;检出量分别为0.32 ng和4 pg。2016年Renata Duarte[16]等建立根据设计RD4的引物的实时定量PCR试验,该方法可以直接从奶样和血样直接检测牛分枝杆菌;通过对当地奶样和血样的检测便可对当地牛结核病进行流行病学调查。2010年谢志勤[17]等根据结核分枝杆菌23S rRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10 copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。

由此可见,实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。它还有其他优点,如出结果更快、能定量、自动化程度更高等。与传统PCR相比在对结核分枝杆菌检测特异性方面提高许多,但由于其灵敏度高、实验操作易受污染等而易出现假阳性,因为只要有微量病原体存在,PCR扩增即可表现为阳性。所以该结果并不能作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义,另外检测需要定量 PCR仪,价格昂贵不易普及。

3 环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplificatial,LAMP)

环介导等温扩增是众多核苷酸扩增技术中的一种,自从Notomi等研究者于2000年公布该技术以来,该技术已经被广泛地应用于生命科学领域,其中就包括对病原体感染的检测。研究者称LAMP已经被广泛地应用于生命科学领域中各个方面,如DNA或RNA的特异高效的扩增。这很大程度上要归功于其特殊的扩增原理：其扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶和4条能够识别靶序列上6个特异区域的引物。靶序列的扩增反应需要在等温条件下进行约1 h。与常规PCR相比,简化样品制备过程,消除DNA提取和LAMP扩增最初的变性步骤从而减少酶的失活。

2010年 陈伟[18]等对临床分离得到的PPD阳性牛的鼻拭子,阳性牛的奶样进行LAMP检测时,得到的阳性率远高于多重PCR检测的数量。2016年zhang H[19]等建立了检测和诊断早期牛结核病的鉴别诊断方法。研究者使用LAMP来检测牛分枝杆菌,基于扩增一个牛分枝杆菌菌株特异基因mpb70。反应体系内仅有7个拷贝基因,LAMP试验都能检测出来;而对于传统PCR,只有70拷贝基因以上才能检测到。基于mpb70基因的LAMP方法能够在人类或动物上区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌,所以LAMP可作为牛分枝杆菌引起的牛结核病诊断的一个潜在工具。

结核分枝杆菌复合群LAMP检测方法具有高特异性和高灵敏度、操作快速简单、成本较低等特点,所以未来在疾病诊断以及核酸检测中将起到重要作用。相信结核分枝杆菌复合群LAMP检测技术将会广泛应用于牛结核病的诊断并会得到有效的大范围推广。LAMP的方法实际上是为了检测人类结核病,该方法也可用于鉴别诊断牛结核病。近几年,随着LAMP检测方法越来越成熟,未来会成为检测技术中的主要方法。LAMP检测方法具有简单快速(只需要一个水浴锅就可以完成检测过程)、高灵敏度、高特异性等优点,是上述几种检测方法所不能够比拟的。

4 结语

总之,分子生物学技术作为检测技术方面具有灵敏、特异、快速等优点,在牛结核病诊断技术领域具有巨大的发展潜力。目前实验室的研究已经取得一定的成绩,现在正准备向牛结核病现场诊断应用过渡,而这个过程也面临诸多问题,如在实验操作方面缺乏一个有效的程序富集牛分枝杆菌以及提高DNA提取浓度问题,因此需要引进精密仪器并由受过专业培训的操作者,根据科学的临床临界值来诊断牛结核病。我国的畜牧业发展状况跟发达国家相比,牛场的实验室条件较差而且牛场一直缺乏一个早期的牛结核病诊断方法,由此造成牛场巨大的经济损失。通过对上述牛结核病分子诊断技术的综述,确定分子诊断技术会在今后牛结核病的诊断中发挥至关重要的作用,尤其LAMP诊断技术可以作为一个简单、便捷、特异、准确性高的早期检测方法,而且它的实验室条件简单、易操作极有可能在规模化牛场中施行。但是该检测技术还不够成熟和完善,其在临床上和牛场上的应用还需要进一步通过试验来验证,若此试验方法能在牛场广泛应用将有利于相关部门准确掌握牛结核病感染情况并及时采取隔离、防控和扑灭等应对措施,大大减少牛结核病感染进一步蔓延和最大程度避免经济损失。也为中国制定根除牛结核病的方案提供可靠性依据。