小鼠及大鼠原代肥大细胞表面唾液酸受体的表达

郭晓桐,孟 迪,霍彩云,唐玉玲,杨光辉,吴宏平,田海燕,胡艳欣

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

A型流感病毒感染可导致人类和动物的急性上呼吸道感染,病毒的快速传播以及较高的发病率和致死率给公共卫生造成了巨大的威胁。流感病毒表面的糖蛋白血凝素(HA)与宿主细胞表面的糖链受体唾液酸(SA)的特异性结合是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的第一步。唾液酸受体的种类和分布对于流感病毒的宿主范围和致病性起到重要的决定性作用,不同的宿主、不同的器官、不同的细胞表达的受体不尽相同[1]。可见,对不同细胞表面唾液酸受体类型进行检测分析,可以确定细胞对何种流感病毒易感,进而揭示病毒入侵细胞的分子机制。

肥大细胞从古老的前哨细胞进化而来[2]。本研究的主要目的是检测分析小鼠和大鼠皮肤、腹腔、肺脏原代肥大细胞表面唾液酸受体的表达情况,确定肥大细胞是否对流感病毒具有易感性,为进一步揭示流感病毒入侵肥大细胞的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2～6月龄BALB/c小鼠(体重为20～30 g,雌雄均可),3～6月龄SD大鼠(体重为150～200 g,雌雄均可),均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂 荧光素标记植物凝集素(Fluorescein-Sambucus nigrabark lectin(FL-1301)、Fluorescein-Maackia amurensislectinⅠ(FL-1311))：Vector Laboratories产品;兔源类胰蛋白酶抗体(Anti-Mast cell Tryptase antibody[EPR8476],ab134932)、山羊抗兔二抗(Goat anti-Rabbit IgG-H&L(Texas Red®),ab6719)：Abcam 产品;胎牛血清(FBS)：HyClone产品;PBS(磷酸盐缓冲液,pH值7.4)、Hank′s液：北京迈晨科技有限公司产品;神经氨酸酶(Neuraminidase)：New England BioLabs产品;多聚赖氨酸、BSA、Triton X-100、Tween-20、胶原酶、透明质酸酶、HEPES、Percoll原液：Sigma-Aldrich产品;DAPI：R&D Systems产品;抗荧光淬灭剂：Southern Biotech产品;甲苯胺蓝、配制Tyrode液和消化液的其他组成成分：北京化学试剂厂产品。

1.3 小鼠和大鼠皮肤肥大细胞的分离 动物经乙醚麻醉后,放血处死,取腹部皮肤切成皮片,分离除去皮下脂肪,用改良的Tyrode液清洗皮片,将皮片剪切成1 mm2大小的小块,放入无菌三角瓶中。经消化液消化、培养箱孵育等以后得肥大细胞,经纯化和鉴定后,用预热的培养液悬浮肥大细胞。

1.4 小鼠和大鼠腹腔肥大细胞的分离 动物经乙醚麻醉后,放血处死,剪开腹部皮肤,暴露腹部肌肉,注射器注入10～30 mL预冷的无Ca2+的Tyrode液,轻轻按摩腹部5 min,注意针头不要刮破腹腔内的脏器,注射器头向下再次插入腹腔,小心将灌洗液吸出,重复1次。将所收集的灌洗液置于50 mL无菌离心管中,4℃条件下800 r/min离心5 min,用预冷的无Ca2+的Tyrode液悬浮沉淀细胞。经纯化和鉴定后,用预热的培养液悬浮肥大细胞。

1.5 小鼠和大鼠肺脏肥大细胞的分离 动物经乙醚麻醉后,放血处死,在无菌条件下,取出正常肺组织10～40 g,立即放入预冷至4°C的TEA液中,在1～2 h内使用。剔除肺组织中较大的支气管和血管,将肺组织切成0.2～1 g的小块,用TEA液洗2次,经消化液消化、过滤组织块后用HACM液悬浮细胞。经纯化和鉴定后,用预热的培养液悬浮肥大细胞。

1.6 小鼠和大鼠原代分离肥大细胞的纯化 使用Percoll细胞分离液对分离的原代肥大细胞进行纯化。离心后弃去上清液,用1.5 mL的Tyrode液重悬细胞,然后将细胞悬液与7 mL的等渗Percoll液混合,将1 mL的Tyrode液铺于8.5 mL的混合物上,500 r/min离心20 min,小心吸取上面的5 mL液体弃去(其中有大量的淋巴细胞和其他的非肥大细胞)。用 Tyrode液清洗细胞 3次,4℃条件下200 r/min离心10 min。

1.7 小鼠和大鼠原代分离肥大细胞的染色鉴定 使用甲苯胺蓝染色法对分离的原代肥大细胞进行鉴定。将10 μL的1%甲苯胺蓝染色液滴于10 μL的细胞悬液中,室温染色10 min。涂片,镜下观察,肥大细胞胞质中的颗粒被染成紫红色,细胞核为浅蓝色。

1.8 细胞爬片的制备 盖玻片经处理后浸泡于多聚赖氨酸工作液中,室温孵育10 min后取出,在超净工作台中展开晾干。胰酶消化细胞后,加入完全培养基充分吹打,使之形成单细胞悬液。将处理好的盖玻片小心放入细胞培养板中,根据需要选择合适的细胞密度接种单细胞悬液。为防止加入细胞悬液时盖玻片漂起,可先在细胞培养板中滴加少量培养基,然后再放入盖玻片。整个过程注意无菌操作。

1.9 细胞爬片的免疫荧光检测 去除细胞培养基,经固定、透化、封闭后进行免疫荧光染色：如为直接免疫荧光染色,则直接加入带荧光标记的抗体,室温下孵育2～6 h;如为间接免疫荧光染色,则先加入一抗,室温下孵育2～6 h或4℃过夜,然后加入相对应的荧光标记二抗,室温下避光孵育45～60 min。用DAPI染核,随后封片在激光共聚焦显微镜下观察。

1.10 神经氨酸酶作用试验 弃去细胞培养基,用预热的DMEM洗3遍。加入稀释好的神经氨酸酶溶液,37°C、5%CO2细胞培养箱孵育3 h。预热的DMEM洗3遍后,根据需要进行细胞感染或其他试验。

2 结果

2.1 小鼠和大鼠原代肥大细胞的分离和鉴定 经分离、纯化、鉴定后的小鼠和大鼠皮肤、腹腔和肺脏的原代肥大细胞,在光学显微镜下观察并比较肥大细胞的形态、数量和纯度。如中插彩版图1、图2所示,甲苯胺蓝将肥大细胞胞质中的颗粒染成紫红色,细胞核染成蓝色,细胞结构完整,大鼠原代分离的肥大细胞直径均大于小鼠,经Percoll细胞分离液纯化后肥大细胞的纯度均可达90%以上。使用Percoll细胞分离液纯化前,经皮肤制备的细胞悬液中含有大量的被毛、皮肤等杂质,此外还含有大量的成纤维细胞、巨噬细胞等,细胞计数结果表明,肥大细胞占有核细胞总数的3% ～5%,大鼠每克皮肤能收获(6.6～8.6)×105个肥大细胞,小鼠数量略少。纯化前腹腔制备的细胞悬液中则主要为单核/巨噬细胞,肥大细胞所占的比例为5% ～10%,大鼠腹腔分离的细胞数有(10～20)×106个/只,其中肥大细胞为(0.4～2)×106个/只,小鼠腹腔分离的细胞数有(1～3)×106个/只,其中肥大细胞为(3～6)×105个/只。肺脏分离得到的肥大细胞数量明显低于皮肤和腹腔,肥大细胞所占的比例仅为1%左右。

2.2 肥大细胞表面唾液酸受体表达的检测 小鼠腹腔和肺脏分离的原代肥大细胞免疫荧光染色结果如中插彩版图3所示,SNA-FITC和MAA-FITC染色均呈阳性(绿色),类胰蛋白酶染色阳性(红色)进一步确定了我们分离到的原代细胞为肥大细胞。经神经氨酸酶处理后SNA-FITC和MAA-FITC染色均呈阴性(左下角插入的小图),确定了唾液酸受体染色的特异性。上述结果表明,小鼠腹腔和肺脏分离得到的原代肥大细胞均同时表达SAα2,6 Gal和SAα2,3 Gal,即同时表达人流感病毒和禽流感病毒受体。

大鼠腹腔和肺脏分离的原代肥大细胞免疫荧光染色结果如中插彩版图4所示,与小鼠相比大鼠分离的原代肥大细胞直径更大,因此表面唾液酸受体染色结果更加明显,与小鼠结果相同,大鼠腹腔和肺脏分离得到的原代肥大细胞也同时表达SAα2,6 Gal和SAα2,3 Gal,即同时表达人流感病毒和禽流感病毒受体。

3 讨论

试验表明,小鼠、大鼠腹腔和肺脏原代肥大细胞表面同时表达SAα2,3 Gal和SAα2,6 Gal,即同时表达禽流感病毒受体和人流感病毒受体。

3.1 原代肥大细胞的分离、纯化和鉴定方法 为了更准确的分析肥大细胞表面唾液酸受体的表达情况,使分析结果更接近体内情况,本研究首先建立了小鼠和大鼠皮肤、腹腔、肺脏原代肥大细胞的分离、纯化、鉴定方法。在原代肥大细胞的分离中我们使用了台氏液,其属于平衡盐溶液的一种,具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必须的能量和无机盐成分等作用,为体外分离细胞的生存及代谢维持提供基本保障。在小鼠和大鼠皮肤的原代肥大细胞分离中使用的为缓冲能力更强的改良的台氏液[3],制备的混合细胞悬液中除含有成纤维细胞、巨噬细胞等细胞杂质外,还含有大量的被毛、皮肤等杂质,肥大细胞在收获的有核细胞中占3%～5%。在小鼠和大鼠腹腔的原代肥大细胞分离中使用的为无Ca2+的台氏液[4-5],其更能促使肥大细胞从组织中脱落,腹腔分离得到的肥大细胞数目更多、纯度更高,制备的混合细胞悬液中杂质细胞主要为单核/巨噬细胞,肥大细胞占的比例为5%～10%。小鼠和大鼠肺脏中肥大细胞含量本身较低,故分离得到的肥大细胞含量最低,肥大细胞所占的比例仅为1%左右。肥大细胞粘附性较差,制备的混合细胞悬液培养一段时间后,轻轻将培养基吸出,即可去除贴壁的其他细胞,在对肥大细胞纯度要求不高时,可达到纯化肥大细胞的目的[3-4,6]。而当对肥大细胞纯度要求较高时,纯化肥大细胞主要有两种方法,一是流式细胞术分选,二是密度离心法,肥大细胞密度在1.09 g/mL与1.17 g/mL之间[7]。本研究中考虑到成本和方便问题,小鼠和大鼠原代肥大细胞的纯化采用的为Percoll密度离心法。甲苯胺蓝染色能与肥大细胞中的肝素结合成特异性紫红色,故可用于肥大细胞的鉴定[8]。

3.2 肥大细胞表面同时表达SAα2,3Gal和SAα2,6Gal两种流感病毒受体 流感病毒通过与宿主细胞表面唾液酸受体的结合来起始感染和复制。目前被普遍接受的流感病毒受体主要有两种,唾液酸α2,3半乳糖(Galactose,Gal)(SAα2,3 Gal)和唾液酸α2,6半乳糖(SAα2,6 Gal)。一般认为,人流感病毒主要识别末端为α2,6 Gal的糖链受体,其主要存在于人类的上呼吸道,而禽流感病毒主要识别末端为α2,3 Gal的糖链受体,其广泛存在于人类的下呼吸道及禽类的胃肠道[9]。除此之外,不同种类的细胞表达的唾液酸受体也有所不同,例如,纤毛细胞表面主要表达SAα2,3 Gal,而非纤毛细胞则主要表达SAα2,6 Gal[10]。目前国际上普遍采用植物凝集素对唾液酸受体糖链位点的特异性进行识别检测：Maackia amurensis agglutinin(MAA)可特异性识别SAα2,3 Gal,作为禽流感病毒受体的标志;Sambucus nigra agglutinin(SNA)可特异性识别SAα2,6 Gal,作为人流感病毒受体的标志[11]。本研究通过植物凝集素免疫荧光染色的方法对肥大细胞表面唾液酸受体的表达情况进行定性检测,首次发现,小鼠、大鼠腹腔和肺脏原代肥大细胞同时表达SAα2,3 Gal和 SAα2,6 Gal两种受体,即同时表达禽流感病毒受体和人流感病毒受体,为禽流感病毒和人流感病毒的吸附、结合提供了基础,据此我们推测肥大细胞可能既可以被人流感病毒感染又可以被禽流感病毒感染。