PCR方法检测猪病料的注意事项

张文通 魏 凤李 峰王金良 苗立中沈志强,

（1山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

随着规模化养殖加速发展，猪病变得极为复杂，仅靠传统诊断效果并不理想。目前从事猪病实验室检测服务的单位主要有农业高校或科研院所、饲料厂或兽药厂、规模养猪场及刚刚兴起的“第三方”专业检测机构等[1-4]。这些服务机构在检测猪病病原时使用最多的方法是PCR方法。PCR方法因其特异、敏感、快速等优点，获得检测人员的高度认可。但在应用PCR方法过程中，如果操作不规范，就会出现“假阳性”或“假阴性”等错误结果，从而误导猪场防疫工作[5-8]。本文对应用PCR方法检测猪病临床病料的一些注意事项进行了概述，以期为检测人员规范操作提供参考。

1 PCR方法介绍

聚合酶链式反应，PCR（Polymerase Chain Reaction），是一种体外DNA扩增技术，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，从而在短时间内获得所需的大量特定基因片段。目前常用的猪病病原PCR检测方法包括普通RCR或RT-PCR、多重PCR或RT-PCR、套式PCR或RT-PCR及实时荧光定量PCR等。

2 PCR方法在临床应用中的注意事项

2.1 对方法要求

使用PCR方法检测某种猪病，需要依据相应的检测标准。检测标准有的是检测人员或单位自建的，有的是来自参考文献，比如文章、论文、专利或标准等。推荐应用国家或行业认可的标准检测方法。比如检测伪狂犬病毒的PCR方法国家标准为GB/T 18641-2002，猪圆环病毒的PCR方法国家标准为GB/T 21674-2008，鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典株复合RT-PCR方法国家标准为GB/T 27517-2011，猪链球菌2型PCR定型检测技术国家标准为GB/T 19915.3-2005，等等。建议检测人员按照国家或行业标准操作，检测结果具有高度准确性或认可性。

2.2 对硬件设施要求

进行PCR试验，需要分区操作，包括模板提取区、配液区、PCR扩增区和电泳区。要求人流及物流严格按照模板提取区—配液区—PCR扩增区—电泳区路线单向流动，严禁倒流。人流与物流通道分开，配液应在生物安全柜中进行，电泳区应有排风及污染物处理设施。这4个区域应配套专用的移液器、枪头、工作服、手套及垃圾桶等耗材，严禁相互交叉使用。还需强调的是：如果做相关基因克隆、质粒提取等工作，禁止在这4个区域操作。上述所有要求都是为了防止“气溶胶污染”。为规范操作，检测人员应做好仪器使用、试剂领取和使用记录。为避免频繁反复冻融PCR试剂，如反转录酶、rTaq酶、引物等，可将其分装成小份使用。对于PCR所用的枪头，要高压处理，如果枪头用于提取和反转录RNA、还需用DEPC水处理。有条件的实验室可做好仪器定期校准验证工作。

2.3 对样本要求

对样本总的要求是新鲜、典型、适量及标识清楚等。送检人员需要根据流行病学调查、临床问诊及剖检结果，对病死猪或病猪病因作出一些推断；根据推断病原，无菌采集典型病变组织，装入自封袋并标识清楚，放入装有冰袋的泡沫箱以最快速度运送至送检单位。

对于猪瘟，主要采集扁桃体、淋巴结、全血、脾、肾；对于猪繁殖与呼吸综合征，主要采集血液、肺、脾、扁桃体、淋巴结；对于猪流行性乙型脑炎，主要采集患病仔猪或死胎儿的脑组织、脑积液和血液；对于猪细小病毒病，主要采集死胎或肾、淋巴结、性腺；对于猪伪狂犬病，主要采集淋巴结、肺、扁桃体、脑；对于猪圆环病毒2型，主要采集肺、胰脏、肾、淋巴结；对于猪口蹄疫，主要采集水泡皮、水泡液、心脏；对于猪传染性胃肠炎，主要采集肠、肠内容物；对于猪流行性腹泻，主要采集粪便、肠内容物；对于猪轮状病毒病，主要采集粪便、肠内容物；对于猪巴氏杆菌病（猪肺疫），主要采集肺（带气管）、淋巴结；对于猪大肠杆菌病，主要采集小肠及内容物、肺脏、心脏；对于猪链球菌病，主要采集肝、脾、淋巴结、肺、血液；对于副猪嗜血杆菌感染，主要采集肺、脑、关节液、淋巴结；对于猪传染性胸膜肺炎，主要采集肺、肝脏、全血、胸水；等等。

2.4 对操作要求

从事PCR检测的操作人员一定要有质量意识。每次PCR检测除了样本外，一定要设置阴阳性对照；严格、详细做好实验记录；注意在每个操作区更换工作服、鞋、口罩、手套等；在核酸提取和配液过程中，每添加1种试剂，更换枪头；每天做完试验，及时清场，进行消毒；注意个人防护，禁止在试验区域饮食，禁止不穿工作服进入试验区域，试验过程中或结束后要用肥皂洗手等。

2.5 PCR检测结果对后续分析要求

大多PCR检测结果仅告诉送检人员有无某个病原，并不能区分是野毒还是疫苗毒、强毒还是弱毒，不能区分病原的基因型。这就需要进一步对送检阳性病料中病原基因组扩增并测序，分析该病原是野毒还是疫苗毒、强毒还是弱毒以及基因型信息，从而推测病原来源以及与疫苗毒株的同源性等，更加精准指导生产。

3 小结

PCR检测在猪病诊断领域已得到广泛应用。但在实践中往往会出现同一份病料送到不同检测单位的检测结果并不一致的现象。提示检测单位的PCR操作水平高低不一，究其原因可能是有些检测单位没有获得国家认可的资质，没有严格的质量管理体系。目前国家正在开展中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认证和中国计量认证（CMA）工作，建议养猪场在送检病料时，选择有资质的机构进行检测。