犬肾脏标记物研究进展

邝 怡,林嘉宝,夏兆飞

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

肾脏损伤或肾功能评估的传统血液检查(如血清肌酐和尿素氮)和尿液检查(如尿蛋白肌酐比和尿比重)被广泛用于临床诊断。但由于目前临床诊断指标的限制性,急需探索更多反映肾小球滤过率(Glomerular Filtration Rate,GFR)和肾小球或肾小管损伤的生物标记物,特别是对肾脏疾病有早期诊断意义的标记物,以便早发现、早治疗,提高宠物生活质量。血液标记物易于采集,而肾脏尿液标记物可能有助于定位损伤部位和评估损伤程度。通常而言,高分子量和中分子量尿蛋白反映了肾小球损伤,而低分子量蛋白则反映肾小管损伤。本综述主要讨论这些新型血液和尿液标记物在犬肾脏疾病诊断的研究进展及其限制性。

1 血液标记物

1.1 肌酐 目前动物临床广泛应用血清肌酐作为肾脏内源性标记物,但血清肌酐水平显著升高时,已有3/4肾脏功能受损。一项犬X染色体遗传性肾病(X-Linked Hereditary Nephropathy,XLHN)研究表明,当GFR平均降低至48%后,血清肌酐才显著上升[1]。另一项研究表明,当3/4肾脏功能失去时,对应的GFR大约为50%～60%或35%～45%(基于菊粉清除率结果)。所以,当GFR降低至约50%或3/4肾脏功能受损后,血清肌酐才会显著上升。血清肌酐浓度与GFR的关系呈直角双曲线关系,即GFR轻度或中度降低时,曲线斜率较小,但当GFR严重降低时,曲线斜率变大。

血清肌酐受多种非肾性因素影响,其中最明显的是肌肉量。此外,大量研究表明,不同年龄、品种和性别等[2-3],都对血清肌酐浓度有不同程度的影响。

当病患肌肉量稳定时,血清肌酐可作为敏感的肾脏功能受损标记物。而当机体状态不稳定或慢性肾衰后期肌肉量急剧减少时,血清肌酐不是肾脏功能损伤的敏感标记物。因此,血清肌酐对肾脏疾病早期诊断意义不大。

1.2 对称二甲基精氨酸(Symmetric Dimethylarginine,SDMA) SDMA是各种蛋白精氨酸通过甲基化修饰和蛋白水解作用产物。多个器官组织均可产生,生产速度相对稳定。SDMA不与蛋白结合,可自由滤过肾小球,绝大部分通过肾脏排泄。

SDMA浓度不受肌肉量、体重、炎症、饮食、品种、体型、性别、年龄(成年)和昼夜变化[4-5]等因素影响。

最近研究表明,SDMA可作为犬GFR内源性替代标记物,特别是对于肾脏疾病患犬。肾脏部分切除模型研究发现,犬SDMA与菊粉清除率相关性强(R=-0.851)[6];XLHN试验犬研究表明,SDMA与碘海醇清除率相关性极强(R=-0.95),患犬血清SDMA变化比肌酐浓度变化更敏感,平均提前2周。当GFR下降小于≤ 34%时,SDMA已有升高[7]。

总而言之,血清SDMA可作为GFR内源性标记物,特别是对于早期肾脏功能下降的患犬而言。由于SDMA不受体重和肌肉量影响,是伴有肌肉量减少的慢性肾脏疾病患犬理想的肾脏标记物。但其他影响SDMA浓度的非肾性因素还需进一步的研究。

1.3 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C,CysC)

CysC是一种小分子多肽蛋白酶抑制剂,可自由滤过肾小球,不经肾小管分泌,滤过后几乎完全被近端肾小管细胞重吸收并分解为氨基酸,机体产生CysC的速率稳定,可作为犬肾脏标记物。

在人医上,血清CysC已被广泛应用于肾脏疾病诊断。研究表明,无论在肾脏患者,还是GFR正常的人群中,血清CysC与GFR的相关性、敏感性和阴性预测率都比血清肌酐高[8]。当用血清肌酐浓度无法计算出准确的GFR时,用血清CysC浓度计算公式,可得到更为精准的GFR[9]。血清CysC可作为早期肾脏损伤排查,但对于慢性肾衰晚期,血清CysC无早期诊断优势[10]。由于尚未有血清CysC的检测标准,血清CysC作为GFR的补充标记物,但不能替代血清肌酐。

在兽医领域,对血清CysC的研究近年来逐渐增多。研究表明,血清CysC与GFR的相关性高[11]。犬严重急性肾损伤(AKI)时,血清 CysC显著上升[12]。但由于该试验没有GFR数据支持,所以其准确性有待考究。

与健康动物和非肾脏疾病动物相比,犬慢性肾病(CKD)患犬血清CysC显著升高。健康犬和患非肾脏疾患犬的CysC范围有部分重叠[11]。但由于大部分试验没有GFR数据支持,所以无法排除早期肾损伤的健康犬或非肾脏疾病患犬,其准确性有待考证。一项试验[11]把CKD患犬分为3组不同程度GFR(菊粉清除率分别为<1.99 mL/min·kg;2.00～2.99 mL/min·kg;≥3 mL/min/kg),结果表明,血清CysC与肌酐和GFR相关性高。与肌酐相比,血清CysC的敏感性(血清CysC:76%;肌酐:65%)高,而特异性稍低(血清CysC:87%;肌酐:91%);血清CysC与肌酐的阳性预测值相似,但血清CysC(69%)的阴性预测值比肌酐(62%)高[13]。碘海醇清除率试验结果与菊粉清除率试验结果相似[14]。

血清CysC可能受年龄、体重、运动和性别影响[15],但由于大部分试验无法确定试验犬是否完全健康,所以结果有待考证。而其他非肾性因素如糖皮质激素、内分泌疾病和肿瘤等对犬血清CysC影响尚未明确。

犬血清CysC与GFR具有一定相关性,而是否可作为早期诊断标记物和其他非肾性因素是否影响其结果,还需要进一步研究。

2 尿液标记物

尿液肾脏标记物主要为蛋白质,根据分子量大小,蛋白质可分为3种:低分子量(<40 kDa)、中分子量(40～100 kDa)和高分子量(>100 kDa)蛋白质。对于健康动物而言,只有低分子量蛋白质可通过肾小球滤过屏障,并通过肾小管被重吸收回体内。所以,低分子量尿蛋白可作为肾小管损伤标记物,高分子量和中分子量尿蛋白可作为肾小球损伤标记物。理想状态下,动物机体尿肌酐排泄量恒定,尿液标记物和尿肌酐都是与尿液量成反比例关系。那么尿液标记物/尿肌酐比率的增加或降低,则可反映该尿液标记物分泌的增加或降低。但当患病动物体况不稳定(如AKI和肾移植术后)时,尿液肌酐排泄也随之变化。所以在AKI中,尿液标记物/尿肌酐的应用仍然存在争议。

2.1 肾小球损伤或功能紊乱标记物

2.1.1 免疫球蛋白 尿液免疫球蛋白是由脾脏浆细胞、淋巴和骨髓合成的糖蛋白,可分为3类:IgG、IgM和IgA。与犬肾脏疾病相关的免疫球蛋白研究主要有IgG和IgM。

AKI患犬尿液 IgG肌酐比(uIgG/c)、uIgG和uIgA均升高,反映存在有肾小球损伤[16-18]。子宫蓄脓时,uIgG/c升高,术后可恢复到健康水平[19]。暂未有犬AKI尿液IgM变化的相关研究。CKD犬的uIgG变化通常早于尿蛋白肌酐比(Bun/Creatinine Ratio,UPC),并在疾病发展的中后期阶段持续上升[20]。uIgM和uIgG与组织损伤相关性高[21]。患免疫介导性肾小球肾炎动物,uIgM和uIgG显著升高,而非免疫复合物肾小球、肾小球和原发性肾小管疾病动物,升高不明显,所以uIgM和uIgG可能作为免疫介导性肾小球肾炎的指示性诊断标记物。这些动物的uIgM和uIgG浓度都与存活时间显著相关[21]。

多项研究表明,脓尿、血尿和细菌尿都会使尿液免疫球蛋白浓度偏高[22-23]。氢化可的松治疗超过24周的比格犬,uIgG/c和UPC逐步增加,并随着治疗的停止,逐渐下降[24]。

因此,排除脓尿、血尿、细菌尿和使用糖皮质激素类药物后,uIgM和uIgG可作为犬肾脏损伤的诊断指标,并对预后有指示性作用,可作为免疫介导性肾小球肾炎的指示性诊断标记物。

2.1.2 白蛋白 白蛋白是由肝脏合成的负急性反应期蛋白,是肾小球、肾小管和肾血管损伤的标记物之一。使用庆大霉素[25-26]、蛇毒、子宫蓄脓[19-20]和肾上腺皮质功能亢进均会导致尿液白蛋白肌酐比(uAlb/c)升高[16,19,24-25]。

2.1.3 C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)

CRP是由肝脏合成的急性反应期蛋白。犬AKI时,尿液CRP肌酐比(uCRP/c)升高[16-19]。子宫蓄脓时,uCRP/c短暂升高、治疗后可恢复至正常范围[19]。健康犬的尿液中无uCRP。

其他肾小球损伤尿液标记物还有犬甲状腺素运载蛋白(Transthyretin)、脂肪连接蛋白(Adiponectin)和铁蛋白(Ferritin)等,在此不做详述。

2.2 肾小管损伤或肾功能紊乱标记物

2.2.1 视黄醇结合蛋白(Retinol-bingding protein,RBP) RBP是一种脂质运载蛋白,主要由肝脏产生。在血液循环中RBP与甲状腺运载蛋白(Transthyretin,TTR)形成复合物,分子量为54 kDa。单独RBP可自由通过肾小球滤过屏障,被肾小管上皮细胞重吸收,而RBP与TTR复合物因不能通过健康动物的肾小球滤过屏障,所以RBP可作为肾小球和肾小管损伤标记物。已有犬血浆和尿液RBP的相关研究,市面上,也有犬特异性RBP的ELISA试纸盒,但尚未有其准确性的相关报道。

犬AKI时,尿液RBP(uRBP)和尿液RBP肌酐比(uRBP/c)暂时性升高,提示肾小管功能紊乱[16-18]。子宫蓄脓病例uRBP/c与组织损伤的相关性高,且术后uRBP/c下降明显[19]。犬CKD时,uRBP、uRBP/c显著上升。uRBP/c的升高出现在氮质血症之前、蛋白尿后,且在整个疾病过程中持续升高(基于血清肌酐浓度),而在疾病中期到后期时,显著升高[20-26]。此外,与其他肾脏标记物相比,uRBP/c与肾小球和组织损伤的相关性最强[20]。蛋白尿对uRBP/c的影响显著[27]。

uRBP不受尿液采集方式、年龄、脓尿、细菌尿、轻度到中度血尿和血红蛋白尿影响[20-25]。但明显血尿样品的uRBP/c轻微升高[28]。

综上,uRBP/c不受除蛋白尿以外的其他多种非肾性因素影响,可作为比血清肌酐更早升高的早期肾小管损伤标记物。

2.2.2 嗜中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)NGAL是一种由嗜中性粒细胞和某些上皮细胞如肾小管表达的微量蛋白,可自由通过肾小球滤过屏障。肾脏损伤时,NGAL被释放至血液和尿液中。受损的肾小管上皮细胞中NGAL合成增加。

两项独立的研究表明,犬注射庆大霉素1 d后,uNGAL/c就已升高,且与肾小管损伤严重程度相关,uNGAL/c可作为庆大霉素诱导的AKI的敏感且预测性标记物[29]。庆大霉素和多黏菌素B诱导的AKI,其uNGAL/c变化与用药剂量相关[29]。氮质血症(无论是 AKI还是 CKD)患犬,其 uNGAL、uNGAL/c和血清NGAL都显著升高[30]。与AKI相似,CKD犬uNGAL/c的升高出现在CKD早期。有蛋白尿的CKD患犬,uNGAL/c与CKD严重程度呈正相关。此外,uNGAL/c与犬肾小球和组织损伤有较强相关性[21]。与健康犬、泌尿道感染和其他下泌尿道疾病患犬相比,CKD患犬uNGAL、uNGAL/c和血清NGAL都显著升高[31]。AKI患犬的uNGAL/c升高较CKD和下泌尿道疾病患犬更为显著。此外,非氮质血症(AKI 1级)患犬,uNGAL/c升高,提示已有肾脏损伤,早于血清肌酐变化[31]。

犬尿液NGAL性状稳定,不受胃炎、蛋白丢失性肠病、肝病肠炎和门静脉短路等影响[30]。uNGAL和uNGAL/c都与体重呈正相关关系[32]。无论是否有氮质血症、脓尿、泌尿道感染和其他下泌尿道疾病(如移形细胞癌和草酸钙结石)都会明显影响uNGAL/c和uNGAL检测结果。

上述可知,uNGAL、uNGAL/c虽然受多种非肾性因素影响,但可作为早期肾损伤(AKI和CKD)的标记物。由于大部分试验没有GFR数据支持,所以还需要进一步试验研究其与GFR的相关性和更多其他非肾性因素对其结果的影响。

其他肾小管损伤或功能紊乱标记物有犬Tamm-Horsfall蛋白、白细胞介素、单核细胞趋化因子-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、α1-微球蛋白、β2-微球蛋白和载脂蛋白A1等。

3 结语

随着人们对犬肾脏标记物的研究越来越深入,至今为止,已发现除肌酐和尿素氮以外的多种犬肾脏标记物。其中,受非肾性因素影响较少的标记物有血清SDMA和uRBP,而对肾脏疾病早期诊断意义的血液标记物有血清SDMA、CysC、尿液免疫球蛋白、uRBP和uNGAL等。此外,对于各种有可能成为有临床应用肾脏标记物,仍需更深入研究,如大规模的临床试验及其临床应用统计数据和其他非肾性因素对肾脏标记物的影响等。

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