胃腺癌组织中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因和环氧合酶-2的表达及相关性

刘 亮 张建海 刘江惠 左连富

(河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室，河北 石家庄 050011)

在全国恶性肿瘤发病中胃癌居第二位，仅次于肺癌，同时数据显示，全国恶性肿瘤死亡第一位是肺癌，其次为肝癌、胃癌〔1〕。恶性肿瘤生长具有无控性旺盛增殖能力，表现出细胞增殖旺盛。细胞增殖周期紊乱与肿瘤发生密切相关，对细胞癌变发生及发展具有至关重要的作用〔2，3〕。细胞周期调控是复杂的机制，多基因、多途径参与调控。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)又称为多种进展期癌突变基因(MMAC)1或转化生长因子调节的上皮细胞富含的磷酸酶(TEP)1，具有磷酸酯酶活性，可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展。PTEN对细胞周期起着负性调节作用〔4〕，可抑制细胞周期从G1向S过渡，抑制细胞增殖〔5〕。环氧合酶(COX)-2又称为前列腺素类过氧化物合成酶，是前列腺素合成的重要限速酶。研究显示，COX-2在多种恶性肿瘤细胞中高表达，且在调控细胞周期〔6〕、免疫力〔7〕及细胞凋亡〔8〕等方面起着重要的作用。本文检测不同胃病变组织中PTEN、COX-2及细胞增殖周期表达及其相互调控与胃癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料 河北医科大学第四医院病理科2010年2月至2012年2月手术切除胃癌标本60例(中、高分化腺癌38例，低分化腺癌22例)，同时取癌旁组织(距肿瘤1～2 cm)60例，均有完整的病理资料。从癌旁组织中经苏木精-伊红(HE)染色筛选慢性萎缩性胃炎18例，胃黏膜上皮不典型增生42例(轻度不典型增生18例，中、重度不典型增生24例)；另取60例正常胃黏膜作为正常对照(标本均取自非恶性肿瘤患者的胃黏膜)，其病理证实均为正常胃黏膜组织。标本均经70%酒精固定，4℃冰箱保存。

1.2仪器及试剂 鼠抗人PTEN抗体及兔抗人COX-2抗体均购自美国Santa Cruz公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗及FITC标记羊抗兔IgG二抗购自美国Jackson Immuno Research；碘化丙啶染料购自美国sigma公司；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。

1.3单细胞悬液样品的制备 流式细胞仪检测的样品需要合格的单细胞悬液，不同病变胃组织单细胞悬液制备使用机械法中的网搓法〔9〕，将制备的单细胞悬液使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，对细胞悬液计数，调整细胞浓度为1×107/ml，备用。

1.4流式细胞术检测细胞中PTEN及COX-2蛋白的免疫荧光标记 将上述制备的单细胞悬液微涡旋震荡混匀后，取细胞悬液100 μl，放入流式细胞仪上样管中，分别加入1∶100稀释的PTEN或COX-2 抗体100 μl，室温放置30 min，PBS洗涤细胞2次，弃上清，分别加入羊抗鼠或羊抗兔FITC-IgG二抗工作液100 μl，室温避光放置30 min，PBS洗涤细胞2次，加入1.0 ml PBS悬浮细胞，经300目尼龙网过滤细胞后上流式细胞仪检测。流式细胞术检测细胞平均荧光强度代表细胞蛋白表达量。

1.5流式细胞术检测细胞增殖周期 将上述制备的单细胞悬液微涡旋震荡混匀后，取细胞悬液100 μl，放入流式细胞仪上样管中，加入碘化丙啶染液(50 μg/ml)1 ml，在4℃温度下避光染色30 min，PBS洗涤细胞2次，300目尼龙网过滤后上流式细胞仪检测。细胞增殖状态以增殖指数(PI)表示，增殖指数(PI)=(S+G2/M)÷(G0/1+ S+G2/M)×100%。

1.6统计学方法 应用SPSS11.5软件进行方差分析，LSD-t检验，t检验，Pearson相关分析。

2 结 果

2.1不同胃病变组织细胞PI 胃腺癌细胞PI〔(33.65±7.01)%〕显著高于胃正常组织〔(17.35±5.44)%〕、萎缩性胃炎〔(18.42±4.53)%〕及胃不典型增生组织〔(23.42±6.43)%,均P<0.01〕，且不典型增生细胞PI显著高于胃正常组织及萎缩性胃炎(P<0.01)，但胃正常组织与萎缩性胃炎无统计学意义(P>0.05)。

2.2不同胃病变组织PTEN蛋白表达水平 胃腺癌中PTEN蛋白表达水平(325.62±37.53)显著低于胃正常组织(365.64±28.58)、萎缩性胃炎(364.60±28.15)及胃不典型增生组织(356.56±23.22，均P<0.01)。胃不典型增生及萎缩性胃炎组织PTEN蛋白表达水平与胃正常组织无统计学意义(P>0.05)。

2.3不同胃病变组织中COX-2蛋白表达 胃腺癌中COX-2蛋白表达(316.17±25.83)显著高于胃正常组织(257.06±29.91)、萎缩性胃炎(261.37±26.29)及胃不典型增生组织(267.18±36.25，均P<0.01)。不典型增生及萎缩性胃炎组织中COX-2蛋白表达水平与正常组织无统计学意义(P>0.05)。

2.4不同分化程度胃腺癌组织中PTEN及COX-2蛋白表达 中、高分化的胃腺癌组织中PTEN蛋白表达(323.53±41.36)与低分化胃腺癌组织(329.23±30.36)无统计学意义(P>0.05)；中、高分化的胃腺癌组织中COX-2蛋白表达(318.83±29.52)与低分化胃腺癌组织(311.59±17.43)无统计学意义(P>0.05)。

2.5胃腺癌细胞PI与PTEN及COX-2蛋白表达的相关性 胃腺癌细胞PI与PTEN蛋白表达呈显著负相关(r=-0.28，P=0.03)，与COX-2蛋白表达无显著相关性(r=0.14，P=0.29)。

3 讨 论

恶性肿瘤细胞呈现旺盛增殖能力，细胞周期紊乱可导致肿瘤的发生及发展。细胞周期调控由多因素多步骤参与。细胞周期调控关键点包括，G1期向S期过渡、S期向G2期过渡调控。PTEN对细胞周期具有负性调节作用，可以抑制细胞周期的G1向S期进程，其具有磷酸酯酶活性，可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展，当其功能完全或部分丧失可能导致肿瘤细胞恶性表型的过度表达，因此PTEN被认为是抑癌基因〔10〕。PTEN能抑制细胞的不正常增殖分裂，参与细胞生长调节〔11〕，并在肿瘤细胞浸润、血管发生及肿瘤转移中起到一定作用。本文显示胃癌细胞具有旺盛的增殖能力，细胞增殖周期的紊乱参与了胃癌的早期发生。PTEN蛋白表达降低与胃腺癌细胞PI增高有关。本文检测到PTEN蛋白结果与张建海〔12〕检测的结果相一致，本文在其实验基础上增加了样本例数并与细胞PI进行了对比。

COX-2是前列腺素生物合成过程中的一个重要限速酶，可将花生四烯酸代谢为各种前列腺素产物，从而维持机体的病理生理过程。研究显示，COX-2与肿瘤的发生、发展有关〔13～16〕，具体表现为COX-2可能导致突变发生，COX-2抑制细胞凋亡、促进细胞黏附，延长细胞周期G1期，降低细胞周期蛋白D1表达，使细胞不能进入分裂，促进肿瘤浸润转移能力并降低免疫功能。本文结果提示COX-2可能通过细胞周期以外的其他机制参与了胃腺癌的发生及发展。

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