外源钙对淹水胁迫下牡丹生理生化特性的影响

潘兵青，朱向涛，潘星桦，戴馨妤，傅 洁，林城妤

(浙江农林大学 暨阳学院，浙江 诸暨 311800)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)，芍药科芍药属落叶灌木，我国特产的传统名花，中国十大名花之一，花大色艳，具有较高观赏价值、药用价值和经济价值[1]。我国江南地区属于亚热带季风气候，降水多且持续时间长，而牡丹具有不耐湿热的特点，江南牡丹群目前品种较少，部分品种已濒临灭绝[2]。江南地区降水过多是影响该地区牡丹生长发育的主要原因，较长时间的梅雨季节伴随着大量降雨，导致牡丹长期处于涝渍胁迫状态下而影响其生长。江南地区耐涝品种的选育、品种结构调整和相应的栽培问题将是未来研究的主要方向。因此，探索涝害对牡丹影响机制并在保护现有江南牡丹品种的基础上培育耐涝的牡丹品种成为迫在眉睫的任务[3]。

钙是植物生长发育过程中的重要元素，能作为第二信使与CaM(Calmudolin)结合偶联胞外信号与胞内生理生化反应，通过稳定细胞结构及诱导特异基因表达来提高植物对逆境的抗性[4]。研究表明，缺钙会导致细胞壁不能形成，影响细胞分裂，进而影响根尖、茎尖等分生组织的形成[5]。目前，关于钙与植物在逆境胁迫的研究表明[6-11]，钙是生物膜稳定剂，能在一定程度上保持植物细胞膜结构和功能，缺钙会引起超氧化物歧化酶(SOD)活性变化，使自由基浓度增加，促进膜脂过氧化作用，从而产生大量MDA，而且钙参与了抗氧化酶活性的调节，从而增强植物对逆境的适应能力。牡丹生长发育与钙供应关系密切，随着钙浓度的增大，牡丹花期可延长，但高浓度钙降低成花率[12]。钙可降低可溶性蛋白质降解速度及乙烯释放速率,提高SOD酶的活性，增加光合速率,从而延缓牡丹花瓣衰老。然而外源钙如何影响牡丹生理生化特性研究尚未见报道，因此，研究外源钙对缓解牡丹涝害的作用具有重要意义。本研究以牡丹为材料，在涝害胁迫下外施CaCl2，试图探讨外施CaCl2对缓解牡丹涝害胁迫的作用，分析不同浓度外源钙处理如何影响牡丹生理生化变化，进而确定最适宜的外源钙浓度，探讨钙对增强牡丹抗涝性的生理机制，为缓解涝害对牡丹的伤害找到经济有效的方法提供基础数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与处理方法

本试验于2016年4-5月在浙江农林大学暨阳学院(29°45′N，120°14′E)进行。供试牡丹品种为4年生卷叶红，生长状况很好，高度50 cm，栽植于上口径28 cm、下口径19 cm、高23 cm的塑料盆，基质是由园土∶沙∶珍珠岩(5∶3∶2)组成的混合基质[3]，利用浸盆法进行淹水处理，对牡丹叶片正反面早晚喷洒各1次，喷洒直至叶片有水滴落，喷洒间隔8 h以上。根据预试验结果，本试验共设4个处理，淹水胁迫下分别喷施浓度为0.6(A)、0.3(B)、0.1 mmol·L-1(C)的CaCl2，以淹水但不喷CaCl2的牡丹作为对照(D)，每个处理完成3次重复，每重复处理3株。在淹水胁迫后2、4、6、8、10 d，取每株幼苗的第1花序下第3～5叶片后用自来水冲去表面污物，再用蒸馏水冲洗2～3次后，用吸水纸吸干表面水分，去掉主脉，测定各项酶活性。

1.2 试验方法和数据处理

叶绿素含量用乙醇浸提比色法[13]测定，细胞膜透性(MP)采用电导率法[14]测定。采用李合生[15]的方法测定过氧化氢酶(CAT)活性；采用赵世杰[16]的方法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)，用考马斯亮兰G-250比色法[17]测定可溶性蛋白质含量。采用Y.Nakano[18]的方法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性。

试验数据采用SPSS19.0和Excel 2016进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 CaCl2对淹水胁迫下牡丹叶绿素含量的影响

由图1可以看出，随着淹水胁迫处理时间的逐渐延长，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素均呈现逐渐下降的变化趋势。涝害使牡丹叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量在短时间内快速下降，而外施钙能够缓解各种色素的下降程度，使色素下降缓慢，叶绿素a/b呈现先升高后降低再升高的变化趋势。总体上来看，在0.3 mmol·L-1钙浓度下各种色素下降程度最慢，有效地降低因涝害造成的色素下降，说明外源钙在一定程度上缓解淹水胁迫对牡丹光合色素的破坏，降低了涝害对牡丹的影响。

2.2 CaCl2对淹水胁迫下牡丹电导率的影响

电导率能够反映植物细胞受破坏程度。随着处理时间的延长，不同处理下牡丹相对电导率均呈持续上升的变化趋势，外源钙在一定程度上缓解淹水胁迫对质膜的伤害，维持细胞膜的稳定性，其中0.3 mmol·L-1的CaCl2处理的叶片电导率呈现上升幅度最小，说明细胞质膜所受伤害小，细胞稳定性较强，而随着处理时间的延长，其他处理均较快上升(表1)。因此，0.3 mmol·L-1的CaCl2处理可以有效缓解细胞膜的氧化伤害。牡丹叶片中的电导率随着淹水胁迫处理时间的加长而增加，在第10天，各处理均达到最高。

2.3 CaCl2对淹水胁迫下牡丹可溶性蛋白含量的影响

随着CaCl2对淹水胁迫下牡丹处理时间的延长，可溶性蛋白呈现先升高后降低的变化趋势，总体变化幅度不大，外施钙浓度为0.3 mmol·L-1时可溶性蛋白增加幅度最大，但在淹水胁迫后期，可溶性蛋白有下降趋势(表2)。在轻度胁迫下，植物可溶性蛋白含量有小幅度上升，说明叶片内可能合成了水分胁迫蛋白，导致可溶性蛋白含量增加。

图1 CaCl2对淹水胁迫下牡丹叶片叶绿素含量的影响

注：表中同一采样期同列数据后不同小写字母表示差异达0.01显著水平，下同。

2.4 CaCl2对淹水胁迫下牡丹SOD活性的影响

SOD酶活性随着淹水胁迫时间的延长呈现先升高后降低的变化趋势，在处理后的第6天，SOD活性最强，之后又逐渐降低。在第10天时0.6 mmol·L-1处理的和不喷CaCl2的活性达到最低(表3)。外源钙处理在一定程度上增强了酶的活性，不同浓度的钙处理，酶活性变化不同，其中钙浓度为0.3 mmol·L-1时SOD活性最大，说明外源钙会调控SOD酶的活性从而增强牡丹的抗涝性，且浓度为0.3 mmol·L-1时效果最好。

表3 CaCl2对淹水胁迫下牡丹SOD活性的影响

2.5 CaCl2对淹水胁迫下牡丹CAT的影响

CaCl2对淹水胁迫下牡丹处理下，CAT活性随着胁迫时间的延长呈现先升高后降低的变化趋势(表4)。外施钙能够显著提高CAT酶的活性，当外施CaCl2浓度为0.3 mmol·L-1时，CAT活性升高幅度最大，表明外施0.3 mmol·L-1的CaCl2，能够显著提高牡丹的抗涝性，第6天时，酶活性均达到最高。

2.6 CaCl2对淹水胁迫下牡丹叶片中APX的影响

随着淹水胁迫处理时间的延长，APX酶活性呈现先升高后降低的变化趋势，在处理后第6天，APX活性最强，之后又逐渐降低，在第10天时各处理的活性达到最低(表5)。不同浓度的外源钙处理后，酶活性变化较大，钙浓度为0.3 mmol·L-1时活性变化幅度最大，主要原因是外源钙具有调控酶活性的功能，在一定程度上增加了牡丹的抗涝性，且浓度为0.3 mmol·L-1时效果最好。

2.7 CaCl2对淹水胁迫下牡丹MDA活性的影响

MDA是植物受到逆境胁迫时膜脂过氧化作用的最终产物,其含量的高低反映ROS对植物细胞膜伤害的程度。结果显示，随着处理时间的延长，MDA含量呈逐渐增加的变化趋势，外源钙在一定程度上缓解MDA的增加(表6)。说明外源钙有一定的增强牡丹抗涝性的作用。从总体上看，MDA含量在0.3 mmol·L-1的CaCl2处理下增加最慢，说明外源钙抑制了MDA的产生，第10 d牡丹MDA含量最高。因此，钙能有效减少牡丹MDA的产生，在0.3 mmol·L-1浓度时作用最显著。

表4 CaCl2对淹水胁迫下牡丹CAT的影响

表5 CaCl2对淹水胁迫下牡丹APX活性的影响

表6 CaCl2对淹水胁迫下牡丹MDA含量的影响

3 结论与讨论

本研究发现，淹水胁迫下牡丹的叶绿素含量呈逐渐下降的变化趋势，电导率逐渐升高，超氧化物歧化酶(SOD)、无氧呼吸酶(CAT、APX)以及可溶性蛋白含量活性均呈现先升高后降低的变化趋势。外施钙可以缓解淹水胁迫对牡丹的伤害，可以减缓叶绿素含量的下降，可以减缓电导率的上升，同时外施CaCl2浓度为0.3 mmol·L-1时效果最显著。

淹水胁迫下，植物能够正常生长发育的机制之一就是诱导抗氧化防御系统起作用。因此，植物抗涝性提高与其抗氧化系统密切相关[19]。SOD是一种重要的抗氧化剂，在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用[20]。CAT、APX是生物体内超氧阴离子自由基的清除剂，可有效地防止胁迫对生物体的损害，并且2种酶几乎参与了生物体对各种逆境的全部生理生化反应，是生物体内重要的抗氧化酶类[21]。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的主要产物之一，具有细胞毒性，容易引起细胞膜功能的紊乱[22]。有研究表明，在培养液中加入一定浓度的钙能显著提高幼苗叶片在低温胁迫下的保护酶活性及保护性物质含量，降低电解质渗透率、MDA含量，从而提高植物的抗涝性[23-24]。本研究表明适量的钙能有效提高牡丹叶片中SOD、CAT、APX的活性，并显著降低MDA的含量，在一定程度上缓解牡丹淹水胁迫伤害，维持其正常的生长发育，使牡丹对逆境的适应能力增强，这与前人研究结果相一致[25-29]。

钙是植物生长的必需营养元素，外源钙可调节植物基因表达、维持细胞膜的完整性、促进生长发育[30]，同时可通过调节氮代谢提高植株对环境的耐受性[31]。本试验结果显示，适量的钙对缓解牡丹在淹水胁迫下的伤害具有明显作用，且在钙浓度为0.3 mmol·L-1时牡丹的酶活性最高，抑制了氧化产物MDA的产生，从而保护了牡丹细胞膜结构的完整性，试验结果证明，高浓度外源钙和低浓度钙均不利于缓解牡丹在淹水胁迫下的伤害。高钙抑制牡丹生长的原因可能是抑制了其他元素(K、Mg)的吸收，从而破坏光合系统进而影响其生长[32-34]，具体原因有待进一步研究。

使用外源钙可以明显缓解牡丹在淹水胁迫下造成的伤害,使植株MDA含量降低,SOD、CAT、APX活性及可溶性蛋白含量增加,并维持在较高水平。这说明钙在牡丹淹水胁迫过程中参与了植株体内细胞保护酶系统的调控,增强了保护酶活性并使之维持在较高水平,减缓了膜脂过氧化过程,从而降低了淹水胁迫对牡丹植株的伤害。

缺钙会使单位叶面积叶绿素含量减少，还会导致叶肉细胞的液泡膜破裂。A.Schwartz[35]等指出，Ca2+参与了气孔开闭的生理过程；F.V.Assche[36]研究认为，钙能提高植物叶片含水量，使叶绿体膜结构保持稳定，增强Rubisco酶和PEP羧化酶活性，从而提高CO2羧化效率。本研究表明，适量的钙能显著提高牡丹叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量。

可溶性蛋白是重要的渗透调节物质，可溶性蛋白的增加和积累都能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用，在植物生理机能衰退、逐渐衰老的过程中，可溶性蛋白含量会逐渐减少。研究表明，外源钙能够提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用，可有效提高牡丹的耐涝性。在浓度为0.3 mmol·L-1时作用效果最佳，这与前人研究结果[37]相一致。

淹水胁迫会使牡丹产生大量的活性氧，造成细胞质膜结构或透性发生改变或丧失，使细胞内的物质大量外渗，引起组织浸泡液的电导率值发生变化[38]，电导率值的大小影响牡丹叶片细胞的状态，电导率值越大说明质膜的伤害程度越大，试验结果显示外施CaCl2可以有效缓解细胞膜的氧化伤害。

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