基于微小RNA调控探讨中医药延缓肾纤维化机制❋

尹佳琦，魏明刚

(苏州大学附属第一医院中西医结合科，江苏 苏州 215006)

慢性肾衰竭是威胁人类生命的主要疾病之一，且近年来发生率逐年上升。慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)则是导致慢性肾衰竭的主要病因。最新流行病学表明，我国CKD患病率约为10.8%[1]，据此可推算我国CKD患者超过1亿人。由于慢性肾衰竭目前仍无有效的治疗手段，依赖血液透析、肾移植等替代治疗不仅增加患者病痛和家庭经济负担，而且加重社会医疗负担，严重阻碍国家经济发展。因此，CKD的防治是世界各国所面临的重要公共卫生问题之一。CKD发展为慢性肾衰竭的必经之路是肾纤维化。肾纤维化早期可表现为肾脏局部炎症,随着病情发展出现肾小管上皮细胞转分化(tubular epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)、细胞外基质(extracellular matrix,ECM) 异常积聚,促使肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终导致肾功能逐渐下降直至丧失而发展为慢性肾衰竭。因此，明确肾纤维化的病变机制、延缓CKD病变发展及保护肾脏功能是减少慢性肾衰竭发病率和患病率的关键。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约22个核糖核苷酸组成的单链、非编码蛋白质RNA，具有高度的保守性和单一的基因集簇性，在动植物细胞分化、增殖、凋亡过程中发挥着重要的调控作用，参与哺乳动物约30%蛋白质编码基因表达。miRNA在肾纤维化进程中起关键作用，中医药在延缓肾纤维化方面与TGF-β/Smads等信号通路关系密切。由此推断，miRNA是中医药延缓肾纤维化直接或间接介质，是治疗CKD的重要靶点，值得深入探讨。

1 miRNA对纤维化相关细胞因子的影响

miRNA可通过相关细胞因子的调控影响肾纤维化的进程。在生理情况下，细胞因子等构成的网络处于平衡状态，但在病理情况下这一平衡被打破。参与肾纤维化常见的细胞因子有转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、结缔组织生长因子(connectibe tissue growth factor, CTGF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)和核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)等。

1.1 miRNA对TGF-β的调控作用

TGF-β是目前作用最明确的致肾纤维化因子，其双刃剑作用表现在正常表达时能抑制炎症反应和细胞增殖，而过度表达时则可引起器官纤维化等病理性改变。TGF-β促肾纤维化主要表现在刺激效应细胞分泌大量ECM；通过抑制ECM降解酶的活性使ECM成分的降解减少；促进肌成纤维细胞增殖，使ECM成分的合成和分泌增加。

Kato、Chung等[2-3]研究发现，miR-192通过下调Smads相互作用蛋白1 (Smad interacting protein 1,SIP1/ZEB2)来增加TGF-β诱导的胶原蛋白(Collagen,Col)表达，介导肾纤维化的发生。Zhong等[4]在糖尿病小鼠模型中发现，miR-21能通过抑制Smad7来提高TGF-β1和NF-κB信号通路的活性，还能增加Col1、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、TNF-α的表达，促进肾纤维化的发生。

Wang等[5-6]发现，在NRK-52E中miR-29家族能明显降低TGF-β1诱导的Col I、III、IV，α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及波形蛋白(Vimentin)的表达。let-7b能减少Smad3活性并明显降低Col I、IV和FN的表达，通过调节TGF-β受体(TGF-β receptor，TGFβR)抑制TGF-β1的信号通路延缓肾纤维化。Wang、Xiong等[7-8]证实，在NRK-52E中，miR-200家族能通过抑制E盒结合锌指蛋白1 (zinc finger Eboxbinding homeobox1, ZEB1)和ZEB2的表达以减少TGF-β诱导EMT的发生，提高上皮细胞标志蛋白上皮钙黏素(epithelial cadherin, E-cadherin)的表达，并降低Vimentin、FN、α-SMA和ColI、IV的表达。

多种miRNAs参与TGF-β的调控，miR-192、miR-21等miRNA促使肾纤维化的发生，而miR-29、miR-200家族、let-7b等miRNA延缓肾纤维化的进程。

1.2 miRNA对CTGF的调控作用

CTGF在人体多种组织器官中广泛表达，尤其在肾脏中表达最丰富。病理状态下，CTGF的表达与器官纤维化有密切联系。CTGF在肾纤维化进程中主要有以下几种表现：一是CTGF具有促丝分裂原的作用，使肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞或肌成纤维细胞；二是刺激ECM发生异常积聚；三是CTGF与TGF-β相互调节。CTGF作为TGF-β的下游介质可以直接激活TGF-β信号通路，而TGF-β促使CTGF表达增加。CTGF具有保守且单一的生物学活性，因此通过直接拮抗CTGF来治疗肾纤维化，可能是一种特异、有效的方法。Koga、Wang、Chen等[9-11]研究发现，miR-19 a、miR-19b、miR-26 a、miR-26b和miR-30c的靶基因是CTGF，这些miRNAs可以直接作用于CTGF的3’端UTR来抑制CTGF蛋白表达，并能使TGF-β/Smads信号通路减弱，从而抑制ECM成分(如Col、FN)异常积聚和α-SMA、Vimentin表达增加，进一步延缓器官纤维化。

CTGF的表达与miRNA的调控存在密切联系， miR-19、miR-26、miR-30等miRNA能降低CTGF水平，从而减慢肾纤维化进程。

1.3 miRNA对TNF-α的调控作用

TNF是一种具有广泛生物学活性的细胞毒细胞因子。TNF-α在肾纤维化进程中的主要作用是，促进巨噬细胞浸润至肾间质，并诱导巨噬细胞中促纤维化的相关细胞因子释放增加；聚集炎症细胞；刺激成纤维细胞增殖，促进ECM成分的合成和分泌；TNF-α与NF-κB的相互作用。McDaniel等[12]研究发现，miR-155能促使脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的TNF-α增多和器官纤维化发生。Zarjou等[13]发现，UUO小鼠模型中，经TNF-α诱导的肾小管上皮细胞中miR-21明显上调，而增加miR-21的表达也能促使TNF-α和Col的表达上调，进一步促使肾纤维化的发生。Zheng等[14]研究发现，增加miR-148 a的表达可以减少TNF-α和IL-1β的释放。Tili等[15]研究发现，miR-125b能直接作用于TNF-α的3’端UTR以抑制TNF-α的表达。Lan等[16]研究发现，在巨噬细胞中，miR-132的增加可以明显抑制NF-κB、TNF-α和IL-6的表达。

TNF-α与器官纤维化的关系十分密切，而miRNA对TNF-α有重要的调控作用。miR-155、miR-21等miRNAs能通过诱导TNF-α加快器官纤维化，而miR-148 a、miR-125b、miR-132等可通过抑制TNF-α的表达来减缓纤维化的发生。

1.4 miRNA对NF-κB的调控作用

NF-κB是细胞中广泛存在的重要核转录因子蛋白家族，具有接受外部信号后快速由细胞质向细胞核转移的显著特点，能够参与细胞分化、凋亡及炎症反应等。NF-κB能直接或间接地影响肾纤维化发生，主要表现在 TGF-β1与NF-κB相互影响，并促使ECM异常积聚，增加TNF-α的表达，也能被TNF-α诱导，加快EMT进程并促进成纤维细胞的增殖。Feng等[17]发现，miR-126通过NF-κB通路明显降低IκBα的表达并增加NF-κB的表达。Murphy等[18]研究发现，let-7 a以直接破坏NF-κB抑制剂的稳定性来激活NF-κB信号通路，使TNF-α表达增加。而miR-125b则增强NF-κB抑制剂的稳定性，从而抑制NF-κB信号通路及TNF-α的表达。Wei等[19]证实，miR-26 a能抑制NF-κB活性，减少ColI、CTGF表达。Bhaumik等[20]发现，miR-146通过NF-κB信号通路上游TNF受体相关因子和IL-1受体相关激酶来降低NF-κB活性。

NF-κB与器官纤维化关系密切，miRNA对NF-κB的调节作用能影响肾纤维化的进程。如miR-126、let-7 a等miRNA能促进NF-κB激活，而miR-26 a、miR-125b、miR-146等能抑制NF-κB激活。

miRNA在肾纤维化的发展过程中起关键作用，miRNA能通过对TGF-β、 CTGF、TNF、NF-κB等肾纤维化相关细胞因子及其信号通路的调控作用来影响EMT进程和ECM成分异常积聚，从而进一步延缓或加速肾纤维化的发展。

2 中医药对miRNA的调控机制及通过调控miRNA对肾纤维化的作用

2.1 中医药可通过Dicer酶发挥对miRNA的调控作用

miRNA在细胞核内由RNA聚合酶II转录成初级转录产物(pri-miRNA)，继而在Drosha酶的作用下生成约70个核苷酸长度组成茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，通过Dicer酶进一步切割为成熟的约22个核苷酸组成的单链、非编码miRNA。Dicer酶是原始miRNA转化为成熟miRNA的关键酶。有研究证实，小鼠卵母细胞Dicer酶的特异性缺失会造成母体miRNA遗传的缺失[21]。Dicer酶不仅是生成成熟miRNA的关键酶，许多研究证实Dicer酶还具有调控miRNA表达的作用。Rupaimoole等[22]研究发现，在缺氧状态下Dicer酶的表达下调，对miRNAs产生的调控作用导致肿瘤细胞生长和转移增加。Yao等[23]发现，在慢性缺氧条件下Dicer酶能调控miR-143和miR-155的表达，以促进细胞葡萄糖代谢的影响。Hartmann等[24]证实，Dicer酶通过调控miR-103抑制Kruppel样因子4，从而促进部分内皮细胞适应不良和动脉粥样硬化。Kuehbacher等[25]研究发现，内皮细胞内转染Dicer酶的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)，能抑制miRNA的生物合成，Dicer酶的siRNA可以降低let-7f和miR-27b表达，从而对血管生成产生影响。这些研究证实，Dicer酶对miRNAs的调控机制能对多种细胞(如肿瘤细胞、内皮细胞等)产生影响。

研究表明，中药对Dicer酶具有调控作用。Yang等[26]发现，补阳还五汤通过干扰Dicer酶来调节miR-126、miR-221、miR-222表达，从而上调血管内皮生长因子的表达，以提高对局灶性脑缺血后间充质干细胞血管生成的影响。Sun等[27]研究证实，雷至胶囊能够减少Dicer酶的表达，调控miR-23 a、 miR-300-3p、miR-24和miR-30c表达，并对肾组织足细胞裂隙膜关键结构分子肾单位、足细胞和骨架蛋白有明显的保护作用，修复嘌呤霉素氨基核苷肾病模型对足细胞结构和功能方面造成的损伤，减少尿蛋白。

因此可以认为，中药方剂通过中药复合物及其活性成分对机体内Dicer酶表达的调控作用，进而发挥其对miRNA的调节作用，从而影响miRNA的表达水平，进一步对细胞的分化、增殖、凋亡等发挥着重要作用。其作用机制可能是中药通过调控miRNA表达，调整机体机能及治疗疾病的重要机制和作用靶点。

2.2 肾纤维化与中医药的联系

肾纤维化的防治与中医药有着密切联系，肾纤维化的形成贯穿于各种CKD发展为终末期肾衰竭的始终。CKD属于中医水肿、腰痛、尿血、关格、虚劳等疾病范畴，其病因病机为本虚标实，但该病病机错综复杂，病位涉及肾、肝、脾、肺、心诸脏，发病主要与肺、脾、肾三脏关系密切。根据现代解剖学可知，肾脏满布血管网，故肾纤维化受到血流动力学的影响。这些细小且量多的血管网属于中医孙络范畴，孙络是络脉中最细小的分支，主要作用是输布气血以濡养全身组织，病理状态下血液运行不利易造成瘀阻，故血瘀是CKD最容易出现的病因，为邪实之首。CKD中所出现的肾脏病理学改变，如血管袢、细胞增殖、Col沉积、血栓形成等都在血瘀的致病结果中。《素问》素有“邪之所凑，其气必虚”的发病观，气虚则推动血液不利易造成血瘀，故从中医发病病机的角度来说，CKD常见于气虚血瘀。

近年来课题组通过一系列的实验研究发现，黄芪、当归、川芎、牛膝等中药可以治疗气虚血瘀且具有多靶点和精准治疗的特色，这些中药可以减少Col和FN等ECM成分异常积聚，抑制TGF-β1信号通路，减少肾小管上皮细胞凋亡等，对肾脏具有保护作用，从而有效延缓肾纤维化进程。

2.3 中医药通过调控miRNA对肾纤维化作用

近年来，关于中药对肾纤维化的影响已有报道。黄芪甲苷(astragaloside-IV，AS-IV)是黄芪的主要活性成分之一，对延缓肾纤维化起到了关键作用；Zhu等[28]发现，AS-IV可以降低大鼠血肌酐、尿素氮并减少TGF-β、CTGF、FN的表达来延缓肾纤维化；Che等[29]证实，AS-IV能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路的活性和TGF-β1诱导NF-kB信号通路激活以减少α-SMA和ECM成分，如ColIV、FN的表达延缓肾纤维化；Wang等[30]研究发现，AS-IV通过调控TGF-β/Smads信号通路来下调TGF-β1、α-SMA表达及减少Smad2/3的磷酸化延缓肾纤维化；Chen等[31]发现，AS-IV能明显上调miR-21转录水平，促进成纤维细胞增生使模型大鼠伤口愈合；Zhang等[32]研究表明，AS-IV能增加miR-122的表达并减少miR-221的表达以治疗肝细胞癌。

阿魏酸(ferulic acid，FA)是当归的主要活性成分之一，有抗炎、抗氧化、抗癌等生物活性。在实验研究中发现，FA可以直接或间接地抑制肾纤维化发展；Wei等[33]研究发现，在NRK-52E中，FA通过调控Smad2/3、ILK及Snail信号通路以明显抑制TGF-β1，使TGF-β1诱导E-cadherin的表达增加而α-SMA表达减少，从而进一步抑制EMT进程；Xu等[34]发现，FA能通过抑制TGF-β1的分泌减少细胞外调节蛋白激酶1和2的磷酸化作用及Smad的转录活性，明显减少ColI和FN表达，进一步抑制肝星状细胞活性。

川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是川芎的主要活性成分之一。研究发现，TMP能有效防治肾小管间质纤维化，延缓肾衰竭的发生发展；Wu等[35]研究发现，TMP能阻断上皮细胞的转分化，使α-SMA表达明显减少，E-cadherin表达明显增加，从而抑制EMT进程，进一步延缓肾纤维化；Lu和Yuan等[36-37]发现,在大鼠UUO模型中，TMP延缓肾纤维化的作用机制表现在两方面：一是抑制TGF-β1、CTGF、α-SMA表达和Col沉积，二是增加Smad7、SnoN蛋白表达，表明川芎嗪能有效防治肾小管损伤,延缓肾间质纤维化；Cheng等[38]研究发现，在NRK-52E中，TMP能抑制阿霉素诱导的NF-κB激活，减少细胞凋亡，从而延缓肾小管间质纤维化；Li等[39]发现，TMP能增加miR-9表达，且TMP与miR-9联合治疗能明显降低α-SMA和ColI的表达，抑制肝纤维化。

齐墩果酸(oleanolic acid，OA)是牛膝的主要活性成分之一。研究表明，OA能抗氧化应激，减少细胞凋亡和ECM表达等，对肾脏有保护作用，并能延缓肾纤维化；Hong等[40]在环孢素A诱导的小鼠肾损伤实验中发现，OA能明显抑制α-SMA表达增加，还能促使抗氧化关键因子核因子相关因子2的表达,从而增加细胞的抗氧化应激能力，减少细胞凋亡和炎症反应的发生，从而延缓肾纤维化；Lee等[41]证实，OA抑制并改善高糖诱导的内质网应激和氧化应激反应的发生，还可抑制TGF-β、Smad2/3信号通路及α-SMA表达并减少细胞凋亡，从而减缓肾纤维化和蛋白尿的产生。Zhang等[42]表明，OA可以降低CTGF、TGF-β及TNF-α水平，明显降低ColⅠ和ColⅢ表达，从而抑制肾纤维化；Zhao等[43]研究发现，在肺癌细胞中OA可以通过调节miR-122的表达起到抗癌细胞增殖的作用；Yi等[44]研究发现，OA能诱导miR-132表达增加以发挥营养神经的作用。OA通过抑制TGF-β、smad2/3、α-SMA的表达及ECM异常积聚，调控miRNAs以发挥抗氧化应激、抗细胞凋亡、降脂等多种作用，在延缓肾纤维化的机制方面值得探究。

综上我们可推测，miRNA可以作为中药方剂及其组分直接或间接介质并成为治疗CKD的重要靶点，从而产生对肾脏的保护作用以延缓肾纤维化的进程。

3 结语

慢性肾衰竭严重威胁着人类的生命健康，而CKD是导致慢性肾衰竭的主要原因。肾纤维化是各种CKD发展为慢性肾衰竭的必经之路。CKD在我国乃至世界的发病率都较高，且至今没有有效的治疗手段，漫长的病程加重患者家庭和社会的经济负担，因此对肾纤维化病变机制的研究就显得尤为重要。肾纤维化的机制是延缓肾纤维化病变发展、保护肾脏功能和减少慢性肾衰竭发病率与患病率的关键。

肾纤维化的发病机制主要体现在纤维化相关细胞因子所促进EMT进程及ECM异常积聚等方面，各细胞因子相互影响、相互作用，仅仅调控单一环节很难有理想的治疗效果。结合CKD的研究现状可发现，miRNA与肾纤维化的发生机制有密切联系。miRNA通过调控以TGF-β/Smads为代表的信号通路影响肾纤维化进程，中药方剂及其组分在延缓肾纤维化方面的作用与TGF-β/Smads等信号通路关系密切，因此miRNA和中药活性成分的关系值得探讨与研究。课题组研究表明，芪归益肾方能通过抑制TGF-β/Smad/ILK信号传导通路来明显增加功能蛋白nephfin的表达，并减少Vimentin表达，保护足细胞的完整性，减轻肾小管-间质损伤以保护肾功能，从而抑制肾纤维化的发展[45-46]。此外，芪归益肾方通过对TGF-β1 /Smads信号通路及其下游信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的抑制，以减少ECM成分的异常聚集，从而延缓肾纤维化进程[47]。

综上，可以把miRNA视为中药方剂及其组分延缓肾纤维化的直接或间接介质，通过对单味中药及其有效提纯物、中药复方的应用及多途径、多层次、多靶点的精准治疗，发挥中医药延缓肾纤维化的重要作用，把中医药运用到治疗肾脏疾病的过程中。而在现有的研究中，miRNA与中医药相关延缓肾纤维化的研究较少，是目前探索研究的重点。

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