小肠维持胆固醇稳态在预防动脉粥样硬化中的作用

陈馨浓，郭晓辰，张军平

天津中医药大学 1研究生院 2第一附属医院心血管科，天津 300193

胆固醇是构成生物膜和髓鞘的重要成分，又是转化为胆汁酸、类固醇激素及7-脱氢胆固醇的前体，对于维持机体正常的生命代谢至关重要。小肠参与胆固醇的吸收、转化、输出与部分合成，协同肝脏维持机体胆固醇内稳态。若小肠功能失衡，使体内胆固醇含量过高，会诱发多种疾病，如动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)等。

体内胆固醇约50%依靠肝脏自身合成，剩余50%需要依赖小肠组织吸收，而肠道中胆固醇主要有3方面来源：食物、胆汁以及脱落的肠上皮细胞，其中胆汁来源的胆固醇约占2/3，余下绝大部分来自于饮食。胆汁的主要成分胆汁酸约5%由粪便排出，95%在回肠末端被重吸收入血形成肠—肝循环。饮食中多为游离胆固醇，可以直接被小肠组织吸收，而胆固醇酯(cholesteryl ester，CE)需要胆汁酸乳化后经胆固醇酯酶水解成胆固醇和脂肪酸才能穿过小肠上皮细胞的刷状缘膜进入细胞内。人类肠道胆固醇吸收率为29%～80%，尽管个体差异大，通过肠道控制胆固醇吸收仍是维持全身胆固醇稳态的重要途径[1]。

小肠参与胆固醇吸收、转化与排泄

小肠参与胆固醇的吸收、转化与排泄过程由一系列复杂的分子机制所调控。首先，被胆汁酸乳化的胆固醇微团通过尼曼—匹克C1型类似蛋白1(niemann-pick C1- like 1，NPC1L1)吸收入肠上皮细胞，之后被转移至内质网，在酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶 2(acyl-CoA∶cholesterol acyltransferase 2，ACAT2)的催化下重新形成CE进入不同的代谢池代谢，绝大部分CE在微粒体三酰甘油转移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTP)的作用下，与载脂蛋白B- 48(apolipoprotein B- 48，apoB48)、三酰甘油(triglyceride，TG)、磷脂等一起组装成乳糜微粒(chylomicron，CM)，经基底膜分泌进入淋巴循环。这也是肠道胆固醇输出的主要途径，其余为日常肠细胞脱落所消耗。未被ACAT2酯化的胆固醇部分通过ATP 结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters，ABC)G5/G8被选择性分泌回肠腔。此外，膜游离胆固醇在ATP 结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)的作用下，与胞外的载脂蛋白A- 1(apolipoprotein A- 1，apoA1)结合形成原始的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)微粒，这种微粒可以进入淋巴循环参与胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)[2]。

NPC1L12004年，Altmann等[3]率先发现NPC1L1对于肠道胆固醇吸收有重要作用。NPC1L1是一种多面体跨膜蛋白，主要分布在十二指肠、空肠和近端回肠的肠上皮细胞刷状缘膜及人类肝细胞微管膜上[4]。啮齿动物NPC1L1选择性表达于小肠而人类NPC1L1在小肠和肝脏都有较高的表达[5]。此外，Kawase等[6]通过研究发现，高胆固醇饮食下大鼠和小鼠的NPC1L1表达有差异，即与大鼠相比小鼠NPC1L1表达明显减少。

至于NPC1L1蛋白转运胆固醇的分子机制，有观点认为NPC1L1是通过与细胞质膜上胆固醇聚集脂筏区域内的Flotillin- 1/2蛋白结合，形成一种富含胆固醇的微结构域，在网格蛋白/衔接蛋白- 2(adaptin- 2，AP- 2)复合物的作用下内吞入细胞形成由质膜和多囊泡构成的内吞循环体(endocytic recycling compartment，ERC)来定向运输胆固醇。当循环体内的胆固醇水平下降时，NPC1L1被重新运送到细胞质膜上再次参与胆固醇的内吞过程，这一过程受到MyoVb·Rab11a·Rab11-FIP2三聚体复合物和Cdc42分子的调节[7- 8]。依折麦布可以通过抑制NPC1L1-Flotillin蛋白-胆固醇微结构域内在化，减少胆固醇吸收来降低血浆胆固醇水平[9- 10]。然而最近Johnson等[11]通过荧光标记NPC1L1，发现其介导的胆固醇吸收不需要循环体参与，且研究显示在RH7777细胞中依折麦布干扰胆固醇吸收不是通过抑制NPC1L1内在化，提示肠道运输某些胆固醇底物可能通过一种非NPC1L1依赖性途径，因此NPC1L1蛋白跨膜转运胆固醇的具体机制仍存在疑问。目前发现一种新的蛋白因子Numb可以与NPC1L1蛋白氮端的特殊结合位点结合，促进clathrin内在化来调节胆固醇吸收。消除小鼠小肠Numb基因或干扰Numb-NPC1L1的相互作用，可以明显降低饮食胆固醇的吸收和血浆胆固醇水平，增加胆汁固醇的排泄[12- 13]。

作为过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)的高选择性激动剂，非诺贝特治疗一段时间后小鼠NPC1L1表达减少且胆固醇吸收降低，证明肠道NPC1L1的表达至少部分被PPARα所调节[2]。此外很多实验已经证明，肝X受体(liver X receptors，LXRs)激动剂可以减少NPC1L1表达，抑制胆固醇吸收[14]。

研究发现，NPC1L1/apoE(-/-)小鼠胆固醇吸收被抑制，血浆胆固醇水平降低，延缓了AS的发生发展[15]。最近一项大规模的人类研究发现，NPC1L1失活性突变与减低血浆低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平有关，并降低了发生心血管疾病的风险[16]。因此，NPC1L1是临床上治疗AS、高脂血症、代谢综合征和肥胖等代谢性疾病的重要靶点。

ABCG5/ABCG8ABCG5 和 ABCG8属于ATP结合盒转运蛋白半转运体，不同于家族其他蛋白含有2个跨膜域(membrane-spanning domain，MSD)和 2 个核苷酸结合域(nucleotide-binding domain，NBD)，ABCG5 和 ABCG8均只含有 1个MSD和 1 个 NBD，二者需结合成异二聚体，组成完整的 ABC 转运体才能发挥转运的作用。Lee等[17]发现，ABC转运体超家族中存在一种新的跨膜皱褶，在活化与未活化ATP酶作用下，跨膜域与核苷酸结合位点耦合不同。且ABCG5/G8区别于其他家族成员，具有不同的拓扑结构、不同位置的耦合和更长的跨膜螺旋(transmembrane helices，TMHs)段胞质延伸。虽然ABCG5/G8介导固醇从质膜流出的分子机制仍不清楚，但其结构有助于理解固醇转运的结构框架，利于研究其他ABCG家族成员结构和功能相关性。

ABCG5/G8高度表达于肝细胞顶膜和肠细胞顶端刷状缘膜上，分别介导胆固醇和植物固醇分泌入胆汁或者肠腔[18]。ABCG5/G8基因突变阻碍固醇分泌，引起固醇沉积形成植物固醇血症，进一步导致早期AS发生。研究发现，ABCG5/G8可以调节TG代谢，ABCG5/G8(-/-)小鼠通过破坏TG分解代谢和增加肝、肠TG分泌，显著增加血浆TG水平[19- 20]。

有研究报道，通过激活LXR增加肠道ABCG5/G8表达，可以促进RCT继而减少AS的发生[21]。Altemus等[22]研究证实，ABCG8基因缺失可以削弱依折麦布依赖性的RCT，且依折麦布抑制肠道胆固醇吸收可以间接增加肝脏ABCG5/G8表达。虽然有文献报道，过表达ABCG5与ABCG8可以选择性促进胆汁中性甾醇的分泌，减少肠道胆固醇的吸收，从而引起胆固醇生物合成与中性甾醇排泄增加[23]。但是，Wang等[24]研究发现存在一种非ABCG5/G8依赖性的途径参与调节人类和小鼠胆汁固醇的分泌，且LXR激动剂可显著增加野生型小鼠胆汁固醇的分泌，而非ABCG5/G8(-/-)小鼠或ABCG8(-/-)小鼠。

ACAT2ACAT在哺乳动物体内有 2 种同工酶：ACAT1 和 ACAT2，其中 ACAT2 主要参与胆固醇的吸收，仅表达于肝脏与小肠细胞。ACAT2又称为甾醇O-酰基转移酶2(sterol O-acyltransferase 2，SOAT2)，是内质网上的一种跨膜蛋白，可以催化游离胆固醇与长链脂肪酰基辅酶A合成CE。有研究证明，抑制小鼠肝脏或者肠道ACAT2表达可以降低血浆胆固醇水平，表现出抗AS的趋势[25]。Ohshiro等[26]发现，apoE(-/-)小鼠应用ACAT2选择性抑制剂PRD125后，血浆胆固醇浓度下降(57.9±9.3)%，胆甾醇油酸与低密度脂蛋白胆甾醇亚油酸酯比值降低(55.6±7.5)%，主动脉粥样硬化斑块显著减少了(62.2±13.1)%，此外也降低了肝脏CE水平和小肠与肝脏ACAT2活性。Zhang等[27]通过研究肝脏ACAT2特异性基因敲除小鼠(liver-specific ACAT2 knockout mice，ACAT2L-/L-)和肠ACAT2特异性基因敲除小鼠(intestine-specific ACAT2 knockout mice，ACAT2SI-/SI-)发现，与ACAT2L-/L-小鼠相比，ACAT2SI-/SI-小鼠胆固醇吸收减缓，血浆低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)与肝脏CE水平降低，而ACAT2L-/L-小鼠可以显著降低血极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)水平，且以上两种小鼠都能够防止食物诱导的肝CE堆积和高胆固醇血症的发生。可见，ACAT2是治疗高胆固醇血症和AS的新靶点。

MTP与apoB脂蛋白生物合成是一个复杂的过程，总的来说需要两个步骤，第1步是跨膜的新生apoB肽局部脂化并在粗面内质网内组织成一个原始微粒。第2步MTP通过在内质网双分子层和脂蛋白受体分子之间往返运送中性脂质，使原始微粒脂质丰富并扩大脂蛋白微粒。

MTP是广泛分布于肝细胞和肠上皮细胞内质网中的一种脂质转运蛋白，能从内质网转移到高尔基体参与VLDL成熟，其可与蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)形成异质二聚体发挥作用，其中PDI含有内质网检索信号，故能通过内质网定位信号受体相关机制确保MTP二聚体复合物从高尔基体转运回内质网[28]。除了肝脏和肠，MTP还存在于其他能合成apoB的组织内，包括心肌、肾、卵黄囊等。作为CD1家族的脂类抗原提呈蛋白质，MTP也表达于不能产生脂蛋白的细胞，如抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)和脂肪细胞中[28- 29]。研究发现，MTP对于组装富含三酰甘油的脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins，TRL)十分重要，如肠CM和肝脏VLDL。消除肠MTP可以明显增加肠道TG和胆固醇水平，减少CM的运输并显著降低肠道胆固醇的吸收，而ACAT2基因缺失可以增加MTP表达，避免高脂饮食下的动物产生脂肪肝[30]。动物实验还提示，抑制MTP活性可以显著减少血胆固醇水平和AS斑块形成。临床试验显示抑制MTP可明显降低纯合子家族性高胆固醇血症患者的LDL-C水平[31]。Dai等[32]发现，核受体家族2 F组成员1(nuclear receptor family 2 group F member 1，NR2F1)与MTP启动子内的多巴胺受体1元件结合抑制细胞MTP的表达。需肌醇酶1β(inositol-requiring enzyme 1β，IRE1β)可以通过转录后途径降低MTP mRNA表达。此外，发现一种新型的肠特异性MTP抑制剂JTT- 130不仅可以抑制脂肪的吸收，也可以抑制嗜食脂类的偏好，防治血脂异常、肥胖和糖尿病等代谢性疾病[33]。

apoB为一种必需的表面结构蛋白，是肠道中形成富含TG脂蛋白的支架，在小肠中表达的apoB主要为apoB48。含有apoB的脂蛋白微粒开始整合时仍可见原先依附于多核糖体的初期apoB转移至内质网腔，且apoB48的前期翻译是复杂的。电子显微镜观察肠特异性apoB基因敲除小鼠发现，仍有大的脂质微粒堆积于内质网腔中，表明肠上皮细胞合成apoB并不影响内质网腔自身合成大的脂滴，而是对脂滴的动员和分泌起重要作用。肠道apoB mRNA的编辑通过一种二聚体复合物调节，这种复合物中包含载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽- 1(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide- 1，APOBEC- 1)、起催化作用的脱氨酶、特异性RNA结合亚基和apobec- 1互补因子(apobec- 1 complementation factor，ACF)。此外，ACF可以影响细胞因子特别是白细胞介素6 mRNA稳定性。研究发现，APOBEC- 1和ACF都有一系列靶点与apoB mRNA不同，该研究结果的生物学意义尚不清楚[2]。Huang等[34]通过研究高脂肪食源性肥胖大鼠，发现奥曲肽干预可以显著降低鼠体质量和血参数，并且下调apoB、MTP mRNA和apoB48、MTP蛋白表达。综上，我们发现apoB与MTP不仅参与胆固醇吸收，同时对于CM途径的胆固醇输出十分重要。

MTP和apoB是脂蛋白形成和分泌的充分必要条件，并且可以调节非脂蛋白分泌细胞系形成apoB脂质结合体并分泌脂质。这两种蛋白的任意一种基因突变或被药理干预都会明显减弱脂蛋白的合成。因为含有apoB的脂蛋白具有促AS作用，干预MTP可以抑制肝、肠细胞分泌apoB和脂蛋白，所以抑制MTP进而影响apoB的产生是预防AS的一项有效策略。此外Dikkers等[35]通过研究发现，MTP也可以潜在促进肝细胞来源VLDLs介导的RCT，抑制MTP激活RCT是临床上防治AS的一个新方向。

ABCA1ABCA1属于ABC转运体超家族“A”分支，包含2个MSD及2个NBD，属于完整转运体。ABCA1在动物体内几乎所有组织都有表达，其中肝脏和肠ABCA1的表达对于维持胆固醇内稳态非常重要。HDL可将肝外胆固醇转运回肝脏进行分解代谢，即RCT，从而降低血胆固醇水平，因此HDL具有抗AS的作用。位于肠细胞内的ABCA1作为一种输出泵，可将胞内游离胆固醇和磷脂转移到胞外的HDL结构蛋白apoA1受体上，从而形成一种未成熟的盘状HDL微粒—前β-HDL。前β-HDL通过卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyl transferase，LCAT)转变成α-HDL，进一步在ABCG1的作用下饱和，形成成熟的球状HDL微粒。因ABCA1可以调节HDL形成速率，又被称为RCT的“看门人”。ABCA1基因突变可以引起血浆HDL和apoA1明显减少，诱发血管壁早期AS损伤，这种HDL缺乏症又称为丹吉尔病[2，36]。Joyce等[37]发现，过表达人类ABCA1基因的C57BL/6小鼠可以调节HDL和包含apoB的脂蛋白代谢，抑制AS发生，故推测增加ABCA1表达能够减少人体内致AS风险。

LXR激动剂可以上调ABCA1表达，促进RCT和肝脏、小肠胆固醇净排泄，是治疗AS的可行选择[38]。人工合成的LXR激动剂GW3965联合依折麦布治疗使肠道ABCA1和ABCG5 mRNA 而非蛋白水平表达增加，伴有肝脏ABCA1表达轻微减少及血浆高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和apoA1水平升高，有效降低肠道胆固醇吸收，促进粪便中性甾醇的排出。单独应用GW3965可增加血浆HDL-C和apoA1水平却没有影响肠道胆固醇吸收，与其相反，应用依折麦布减少肠道胆固醇吸收，但没有影响HDL-C和apoA1水平。因此，LXR激动剂诱导的HDL-C和apoA1水平增加不依赖于肠道胆固醇吸收，且不需要肠道和肝脏的ABCA1 表达增加[39]。此外，Mo等[40]通过观察apoE(-/-)小鼠发现，晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products，AOPPs)通过JAK激酶(Janus kinase，JAK)— LXRα信号通路下调ABCA1和ABCG1表达，导致脂质堆积使AS加剧。可见，上调ABCA1和ABCG1表达是治疗AS的可行策略[41]。

最近发现一种新的跨肠道胆固醇排泄(transintestinal cholesterol excretion，TICE)途径，即由肝脏生成的apoB充当转运体，将胆固醇转运至低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)或其他受体上，再通过ABCA1、ABCG5/G8运送至肠腔，LXRα可以促进这一过程[42]。此外，Nakano等[43]发现，依折麦布可以通过作用于TICE，调节胆固醇从刷状缘膜流入肠腔，从而影响胆固醇吸收。TICE提供了将外周胆固醇转移入肠腔经排泄物清除的非胆汁转运依赖机制，丰富了胆固醇清除的多样化途径[44]。

小肠参与胆汁酸吸收

胆汁酸由肝脏产生，参与膳食脂质和脂溶性营养物质的吸收。由于机体自身合成的胆汁酸有限，需要肠道重吸收胆汁酸进行肠肝循环反复利用。胆汁酸分为游离胆汁酸和结合胆汁酸。其中游离胆汁酸通过扩散作用重吸收，结合胆汁酸通过位于回肠肠上皮细胞刷状缘膜的顶膜钠依赖性胆汁酸转运蛋白(apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT)重吸收入小肠黏膜细胞，并与胞内回肠脂质结合蛋白(ileal lipid binding protein，ILBP)结合，从顶膜转运至基底膜，最后通过有机溶质转运体(organic solute transporter，Ost)α-Ostβ释放入门静脉。实验证明ILBP对于维持小鼠肠肝循环中的胆汁酸稳态至关重要，且ASBT和Ostα任何一种失活都会影响肠道胆汁酸的转运[45- 47]。尽管如此，另有研究发现，ASBT/apoE(-/-)小鼠而非Ostα/apoE(-/-)小鼠可以降低血浆胆固醇水平并延缓AS发生，实验亦表明阻碍ASBT基因表达可以降低血浆脂蛋白apoB水平和大动脉的胆固醇沉积。上述研究证明ASBT是治疗AS的另一可靠靶点[46，48]。

肠道法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)影响ASBT、Ostα-Ostβ和ILBP的表达，对维持胆汁酸稳态有重要作用。胆汁酸激活回肠上皮细胞FXR，增加成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)15表达(人类为FGF19)，FGF15转运至肝脏通过成纤维细胞生长因子受体4(fibroblast growth factor receptor- 4，FGFR4)和β-klotho复合体来抑制胆固醇7α-羟化酶(cytochrome P450 gene cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)表达和胆汁酸合成[47，49]。激活FXR可以通过减少肝脏胆汁酸合成促进RCT，并抑制肠道胆固醇吸收，还可以降低血TG水平，从而延缓AS发生[50]。此外，Lan等[46]发现，抑制回肠FGF15表达后，伴有肝脏CYP7A1表达增加及胆汁酸合成增多，亦可发挥抗AS的作用。最近有研究结果显示，肠道FXR可能作用于靶基因FGF15(FGF19)调节TICE，进而提高胆盐池的亲水性，发挥预防心血管疾病的作用[51]。

干扰胆汁酸的肠肝循环可以促进肝脏利用胆固醇合成胆汁酸，并清除血浆中包含apoB的脂蛋白。胆汁酸螯合剂通过与胆汁酸结合阻碍它们重吸收并有效降低了胆固醇的吸收，是治疗AS的另一个方向[46]。

小肠参与脂蛋白分泌

小肠除了摄取和转运脂类物质，还是肠道脂蛋白分泌的重要调节者。对于餐后脂蛋白异常代谢相关疾病，如胰岛素抵抗、2型糖尿病和AS有重要影响。这些疾病的血脂异常主要表现为空腹及餐后TRL与含有apoB48的脂蛋白微粒含量升高，HDL-C降低，小而密的LDL微粒增加。apoB48与餐后血脂、颈动脉厚度和动脉病变有关。空腹apoB48浓度是衡量AS风险的有效指标，apoB48/TG比值是检测早期AS的标志[52- 53]。TRL在脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)的水解作用下产生残余微粒和血浆游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)。这些残余微粒含有相对丰富的CE，可以诱导泡沫细胞形成，这是导致AS的关键一步。此外，残余微粒可以通过促进祖细胞衰老和氧化应激导致的凋亡改变内皮细胞功能，也可以加强肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的炎症反应[54]。

最近发现单糖、FFA、白藜芦醇、肠肽[如胰高血糖素样肽- 1(glucagon-like peptide- 1，GLP- 1)和GLP- 2]和胰岛激素(如胰岛素)是肠道脂质分泌的重要调节者。临床和动物实验均表明，小肠不仅是一个吸收器官，还可以调节空腹或餐后CM的生产率[52]。此外，它能储存一部分吸收的膳食脂质，推迟CM的释放[54]。CM生产率过高导致血脂异常，可能增加AS风险。近期相关研究证据都表明，调节肠道脂蛋白分泌治疗血脂紊乱是预防AS的可行方法[52]。

展 望

AS引起的心脑血管疾病已经成为威胁人类健康的主要病因，而血中胆固醇浓度过高是主要因素，降胆固醇药物一直是医药领域研究的热点。他汀可以通过干预胆固醇合成，发挥抗AS作用，且疗效肯定。而小肠作为人体维持胆固醇代谢稳态的重要器官，可以成为预防AS发生发展的新治疗靶点。目前，依折麦布是唯一批准上市的干预胆固醇吸收的药物，它与他汀类药物合用可以发挥更好疗效。此外，胆汁酸螯合剂如考来烯胺等，可以通过阻碍胆汁酸重吸收、促进其排泄来降低血浆胆固醇水平。鉴于上述药物都具有某些不良反应，通过分析和归纳小肠参与维持胆固醇稳态的相关分子机制，我们可以研究一些新的作用靶点，例如：(1)干预NPC1L1和Numb基因表达或相互作用；(2)ABCG5/ABCG8 激动剂；(3)通过抑制 ACAT2 的表达降低胆固醇的酯化；(4)抑制MTP减少apoB或激活RCT；(5)ABCA1和ABCG1激动剂；(6)小肠LXR特异性激动剂；(7)调节肠道脂蛋白分泌等，这些作用靶点都可以作为未来研究的方向，指导后续降脂药物的研发工作。

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