Wnt信号通路在胚胎着床中的作用

唐业东，张正红，唐宗浩，王正朝

福建师范大学生命科学学院福建省发育与神经生物学重点实验室，福州 350007

囊胚成功着床到母体子宫内膜中，是成功妊娠和胚胎进一步发育的必要条件，与许多发育过程相似，胚胎着床蕴含着复杂的分子机制。在小鼠中，子宫腔和腺上皮细胞在妊娠的第1天至第2天开始处于增殖状态，随着时间的推移，这些细胞从细胞周期中退出并进入允许其转变为接受状态的分化程序。与上皮相邻的基质细胞在妊娠的第3天开始增殖，并且在第4天时，胚胎附着于子宫腔上皮，随后这种增殖变得普遍。当胚胎通过管腔上皮进入基质中时，基质细胞将逐步分化成分泌性蜕膜细胞，用以支持着床的胚胎进一步生长和发育，直到胎盘形成[1]。在此期间，Wnt信号通路发挥了重要的调控作用。Wnt家族成员最知名的是在胚胎发育过程中对细胞命运决定、增殖、分化和凋亡中的调控作用，其主要通过与受体、效应物和抑制物之间的相互作用在组织或器官发育过程中发挥功能。现有研究表明，Wnt家族成员对哺乳动物胚胎着床前子宫内膜的改变和早期胚胎的发育过程具有至关重要的调控作用[2- 3]。

胚胎着床过程

在哺乳动物中，胚胎着床过程涉及激活胚胎与接受态子宫内膜之间的相互作用，主要包括激活囊胚的定位、黏附以及植入过程[4- 5]。激活的囊胚成功着床到母体子宫内膜中，是成功妊娠和胚胎进一步发育的重要条件。囊胚必须在称为“着床窗口”的有限时期内植入到母体子宫内膜中[6- 7]，即胚胎着床能力的获得与子宫内膜接受态的建立必须同步。子宫对正常囊胚着床的敏感期主要可分为3个阶段：着床前期，着床期及不应期。在小鼠的着床前期，妊娠第4天之前，通常认为子宫处于接受前期；妊娠第4天，在卵巢的黄体激素和着床前雌激素的诱导下，子宫将处于完全接受态；妊娠第5天下午开始，子宫将进入非接受态时期，即不应期。当子宫处于接受态时，将诱导胚胎着床的发生，进入着床期，此时子宫腔上皮细胞将发生动态变化，如小鼠怀孕第4天的早晨，在孕酮和雌激素的诱导下，子宫腔上皮细胞停止增殖，与此同时，上皮细胞经历分化，伴随着动态的连接复合体重塑和细胞膜的成熟，导致着床位点周围的上皮细胞极性下降，细胞形态由柱状变为立方型，从而逐步实现囊胚在第4天晚上附着在子宫壁上的能力[8- 9]。胚胎着床后，在着床位点周围的子宫间质细胞将经历大范围的增殖和分化，这一过程被称为蜕膜化。这种子宫基质向蜕膜转化的过程，主要由孕酮和雌激素调节，所形成的蜕膜床负责向胚胎提供营养并形成屏障，以防止在胎盘成熟之前滋养层侵袭不受控制。因此，正常发育的蜕膜对于成功妊娠至关重要[10]。

Wnt信号通路

Wnt信号通路与生物体中的多种关键功能相关，如增殖、分化、炎症、再生和凋亡等[11- 13]。由Wnt配体激活的信号传导可分为两类：经典的Wnt/β-catenin依赖性途径与非经典的β-catenin非依赖性途径。在哺乳动物中，已经鉴定出19个Wnt配体：Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16；10个跨膜G蛋白偶联受体Frizzled1- 10(FZD1- 10)和2个低密度脂蛋白受体相关蛋白 (low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)：LRP- 5和LRP- 6[14]，并且每个组分都展示出不同的表达模式和功能[15- 16]。然而，一个Wnt配体可以激活多个途径，这取决于下游组分的表达[17]。Wnt信号通路的失调与多种疾病相关，如癌症、阿尔茨海默症、精神分裂症、糖尿病和帕金森病等，目前的研究已经将Wnt信号通路作为治疗多种疾病的潜在靶点[11，15，18- 19]。

β-catenin依赖性途径β-catenin是一种多功能蛋白，在细胞增殖、分化、生长和存活等多种生理过程中具有至关重要的作用，同时也是Wnt信号通路的主要参与者，在发育起始及成体组织平衡中发挥着重要作用[20]。β-catenin位于细胞基质中，可以与由轴蛋白 (Axin)、腺瘤性息肉病大肠杆菌(adenomatous polyposiscoliprotein，APC)、糖原合酶激酶- 3B(glycogen synthase kinase- 3B，GSK- 3B)和酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α，CK1α)组成的泛素蛋白酶复合物相结合，其激活与抑制取决于信号通路的开关。当β-catenin结合Axin和APC蛋白时，将会被GSK- 3B和CK1α磷酸化，进而导致其被泛素蛋白酶复合物降解。在FZD与Wnt配体相互作用时，其可与LRP家族的成员共同作用，产生的信号通过蓬乱蛋白(Dishevelled，Dsh)转导到β-catenin降解复合体，以避免β-catenin的磷酸化和降解。因此，β-catenin能够以未磷酸化的形式累积在细胞基质中，当达到一定的量后，便可以转移到细胞核，在细胞核中，β-catenin通过置换转录抑制子Groucho蛋白家族(transducin-like enhancer of split，TLE)作为Wnt靶基因的转录共调节子，然后与T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)转录因子家族的成员结合来调控Wnt靶基因的转录[20- 23]。

β-catenin非依赖性途径β-catenin非依赖性途径被定义为与β-catenin转录功能无关的Wnt-或FZD-启动的信号，包含了多种复杂的信号途径，如Wnt/planar cell polarity (PCP)、Wnt-cGMP/Ca2+、Wnt/cAMP、Wnt/ROR、Wnt/RAP、Wnt/RAC和Wnt/RHO途径。其中Wnt/PCP和 Wnt-cGMP/Ca2+途径的特征较为明显[24]。

Wnt/PCP途径最初是在果蝇中鉴定出来，由非经典Wnt信号配体Wnt5a或Wnt11与FZD和Dsh结合诱导，然后，激活的Wnt/PCP信号通路可通过Dsh活化Rho家族GTPases酶(pros-homologous A，Rho A)和Rac蛋白，以及它们的下游靶点Rho相关的卷曲螺旋蛋白激酶1(rho-associated，coiled-coil-containing protein kinase 1，Rock1)和JNK1激酶(JunN terminalkinase1，JNK1)，与转录因子激活蛋白- 1(activator protein- 1，AP- 1)及c-jun的氨基末端区域结合后，具有诱导下游靶基因表达的能力，从而在调节细胞极性、细胞运动和形态发生运动方面发挥突出作用[24- 26]。

Wnt-cGMP/Ca2+途径最初在非洲爪蟾和斑马鱼胚胎中发现[27]，内质网中的Ca2+释放入胞浆是Wnt/Ca2+信号途径中的关键步骤，进而Wnt/FZD结合复合物将使胞浆中的Dsh活化，一方面可通过抑制阻止Ca2+释放的cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP dependent protein kinase，PKG)使内质网Ca2+释放增多，另一方面可通过激活磷脂酶C(phospholipase C，PLC)和升高1，4，5—三磷酸肌醇(1，4，5-trisphosphate rinositol，IP3)使细胞质游离的Ca2+增多，然后升高的Ca2+可进一步激活Ca2+相关蛋白酶，如钙调磷酸酶、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CamKⅡ)[24，28]。后来的研究发现，CamKⅡ可以进一步激活TGF-β激酶(TGF-β-activated kinase 1，Tak1)以及NEMO激酶(nemo-like kinase，NLK)，使TCF磷酸化，从而抑制经典Wnt信号通路的活性[29]。而钙调磷酸酶可进一步活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NF-AT)和核因子κB (nuclear factor，NF-κB)等转录因子，进而诱导下游靶基因的表达[30- 31]。

Wnt信号在围着床过程中的作用

在Wnt信号传导中，β-catenin在腺和基质细胞中表达，并在子宫内膜周期的增殖期和分泌期期间高度表达，参与胚胎着床和子宫内膜增殖、分化和蜕膜化[3]。在小鼠中，Wnt/β-catenin信号通路的沉默会阻碍胚泡的着床，子宫条件性缺失β-catenin或过表达β-catenin也影响正常的着床和蜕膜化过程，子宫条件性缺失Wnt4将导致胚胎着床和子宫蜕膜失败[32- 33]。在人体中，孕酮可以诱导蜕膜化期子宫内膜基质细胞表达经典Wnt信号通路的分泌抑制物Dickkopf- 1 (DKK- 1)，且妇女子宫内膜DKK- 1的异常表达与胚胎着床受损相关[34]。此外，Wnt5a在人类子宫内膜蜕膜化过程中介导孕酮的功能。由此可见，Wnt信号通路在小鼠和人的胚胎着床以及蜕膜化过程中起着重要作用[32]。

Wnt信号与子宫内膜接受态的建立胚胎的成功着床要求子宫功能健全且子宫腔上皮处于接受态，同时需要激活囊胚使其能与子宫壁附着。在子宫接受态前期到子宫接受态配置完成的过程中，子宫腔上皮会发生动态的膜重组和去极化，及时调控上皮细胞膜的成熟并保持子宫腔上皮的完整性，对于人类和小鼠的胚胎着床过程具有至关重要的作用[8]。在此过程中，Wnt信号被认为是在子宫内膜功能的正常发挥过程中的重要因素[35]。

胚胎着床需要雌激素和孕酮的协调作用。在啮齿动物中，雌激素刺激子宫腔上皮和腺上皮的增殖、分化，而且在基质细胞的分化过程中，雌激素和孕酮都是必需的[36]。为了研究人子宫内膜基质细胞中雌激素和β-catenin信号传导分子机制，Xiong等[37]发现在人子宫内膜基质细胞中，雌激素以时间和剂量依赖性的方式诱导β-catenin RNA和蛋白质的表达，然后与TCF/LEF家族结合，增加子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells，ESC)层的血管生成。同时，Zhang等[22]研究发现，雌激素诱导的β-catenin可以上调ESC中的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，从而促进了子宫内膜异位症患者病变血管的生成。此外，在小鼠子宫接受态建立的过程中，即在小鼠妊娠的第3～4天，Cha等[38]在其子宫中检测出Wnt5a基因的时空表达，也表明Wnt5a与小鼠子宫的接受态建立有关。

Wnt信号与囊胚激活囊胚的激活对于成功的着床过程至关重要，在此过程中，囊胚获得了附着于接受态子宫内膜的能力[39]。早期实验证明，经典Wnt信号通路的异常对于囊胚的形成没有明显的影响[40]，但是，在囊胚激活的过程中却发挥着至关重要的作用[41]。例如，De Vries等[42]的实验结果表明，与对照组小鼠相比，卵母细胞中条件性缺失β-catenin的雌性小鼠与野生型公鼠交配后的产仔数显著减少。而Xie等[39]也利用DKK- 1或小分子抑制剂阻断经典Wnt信号通路，证实了经典Wnt信号的抑制将会损害囊胚植入子宫内膜的能力，同时也发现了经典Wnt信号通路的正常表达需要与非经典的Wnt/RhoA信号通路的阻断相结合时，才可以使得囊胚具有正常的植入能力。Tsang等[43]利用Wnt3a或氯化锂处理诱导Wnt信号途径从而使囊胚获得附着能力，被成功激活。由此可见，Wnt信号通路在囊胚激活的过程中同样具有不可替代的作用。

Wnt信号与胚胎着床在小鼠中，妊娠1～3 d的子宫处于接受态前期，胚胎不能着床；妊娠第4天处于完全接受态，在第4天夜晚，囊胚着床部位的子宫内膜血管通透性增加且囊胚附着在子宫腔上皮；在妊娠第5天，当基质细胞开始扩大和分化为蜕膜细胞时，将使得着床变得更加牢固[9]。胚胎着床对于成功妊娠至关重要[4- 5]，且只能在“着床窗口”期间发生[6- 7]。在这个关键阶段，许多因素可以调节子宫内膜细胞中各种功能蛋白的表达水平，包括激素、生长因子、细胞因子等。Wnt信号通路的激活在此过程中扮演着重要的角色[39]。胚胎附着于子宫腔上皮和入侵到子宫内膜是早期妊娠的关键事件，为了确定Wnt4是否在此过程中起作用，Franco等[33]利用对照组(Wnt4f/f)和Wnt4双敲除(Wnt4d/d)雌性小鼠与输精管切除的雄性小鼠交配，在第0.5天时，将野生型小鼠囊胚移植到实验组小鼠的输卵管中，且在第5.5天时检测着床位点数，结果发现Wnt4d/d小鼠胚胎着床能力明显下降。

Wnt5a作为非经典的Wnt配体，在着床子宫中存在时空表达。Cha等[38]利用LoxP-Cre系统，构建了子宫中Wnt5a基因灭活(Wnt5ad/d)和过表达(Wnt5aGOF)的小鼠模型，结果发现突变型小鼠的卵巢功能正常，但Wnt5ad/d小鼠生育能力严重受损，Wnt5aGOF小鼠的生育能力也出现了一定的损伤，怀孕母鼠的胚胎着床能力较对照组明显脆弱，且显示紊乱的胚胎着床倾向，后期发育过程中胚胎的重吸收率也明显上升。

由于在子宫肌层和基质中过表达β-catenin的小鼠的输卵管出现畸形，最终将导致小鼠不育[44]，所以Patterson等[23]利用胚胎移植技术，绕过畸形的输卵管进行胚胎着床，结果发现由于基质细胞蜕膜化过程受到过表达的β-catenin干扰，导致着床位点数显著少于对照组，表明间质和上皮之间的旁分泌信号传导对于子宫接受胚胎着床和随后的蜕膜化过程至关重要，同时多种信号途径参与其中，如STAT3信号通路。当这些途径受到干扰时，将会阻碍胚胎着床和蜕膜化的进行，而在子宫“着床窗口”期间，过表达β-catenin的突变体小鼠子宫中pSTAT3表达受阻[23]，这些结果表明了Wnt信号对胚胎着床的重要性，且在着床后期的子宫基质蜕膜化过程中同样不可或缺。

Wnt信号与子宫基质蜕膜化蜕膜化是子宫内膜基质细胞增殖、分化为蜕膜细胞的过程，主要由孕酮引起。在小鼠妊娠的第4.5天，囊胚附着到子宫上皮后开始蜕膜。在附着反应之后，着床囊胚周围的基质细胞增殖并分化形成蜕膜床。在妊娠期间，蜕膜细胞产生激素和细胞因子，这对胚胎发育至关重要，如在妊娠期间分泌控制滋养层侵袭的因子。而Wnt信号通路同样参与了子宫内膜基质蜕膜化过程[32]。

Wnt5a不仅在着床过程中起作用，同样也会影响蜕膜化过程，如敲除或过表达着床子宫中的Wnt5a信号将导致初级蜕膜区形成异常。在着床开始时，随着Bmp2在囊胚周围的基质中表达，蜕膜化程度明显增加，说明Bmp2在此过程中发挥重要作用，而异常的Wnt5a信号表达会降低Bmp2的表达活性，从而干扰基质细胞的蜕膜化进程[38]。同时，Wnt6的缺陷也会大大妨碍子宫基质的蜕膜化过程[32]。在妊娠第7～8天，Wnt6缺陷型(Wnt6-/-)小鼠着床部位的重量和大小都显著降低，野生型(WT)小鼠子宫在假孕第4天时，子宫腔内注射油，4 d后表现出强烈的蜕膜反应，而Wnt6-/-小鼠子宫中的蜕膜反应却显著减少[32]。在检测的12只Wnt6-/-小鼠中，有6只小鼠蜕膜化程度较低，其他6只甚至缺乏蜕膜反应，这说明Wnt6对正常子宫蜕膜化至关重要，进一步研究发现Wnt6缺乏会减少细胞周期蛋白B1的表达，从而延长细胞周期，最终阻碍子宫间质细胞增殖[32]。而Wnt4敲除小鼠的子宫存在缺陷，使小鼠生育能力下降[33]，表明Wnt4在胚胎着床过程中具有调节基质细胞蜕膜化的作用。在子宫发育和妊娠期间，β-catenin活性必须严格调控，因为功能丧失和过表达β-catenin都会导致成年小鼠的生殖缺陷[23]。由此可见，Wnt信号通路对于小鼠蜕膜化过程的正常进行的重要性。

总结与展望

胚胎着床是妊娠过程的一个关键环节，对哺乳动物的成功妊娠与胚胎的早期发育具有非常重要的意义。Wnt信号通路已被证实在胚胎着床过程中发挥重要的调控作用，包括接受态的建立、囊胚的激活、胚胎着床的调控以及蜕膜化过程的发生。在人体中，Wnt信号调控蜕膜化、子宫内膜功能和滋养细胞分化，并且在生殖相关疾病的研究中也发现了Wnt信号的异常变化，如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和先兆子痫等。通过研究Wnt信号通路在胚胎着床以及相关疾病中的作用，有助于进一步了解胚胎着床及其相关疾病的发生机制，对于生殖疾病的治疗研究具有重大意义。

目前，生殖疾病在人类中具有较高的发病率，严重影响人们的健康与生活质量，然而，相关的发病机制仍有很大程度上的未知。因此，积极开展生殖生理功能的调控以及相关疾病的发病机制研究具有重要的临床意义，不但可以为开发新靶向性药物提供重要的理论基础，还可以为人类生殖相关疾病的预防、诊断和治疗提供新的治疗方案和线索。

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