长链非编码RNA在肺纤维化中作用机制的研究进展

周俊海，黄瑞雪

（中南大学湘雅公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，湖南长沙 410078）

肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质沉积并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变。石棉、矿物粉尘、药物和放射损伤等多种因素均可导致肺纤维化［1］。针对肺纤维化，现有措施主要是重在预防和改善肺功能，治疗上尚无有效特异性药物使用对策，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），长度＞200核苷酸，缺少开放阅读框，不编码蛋白质。研究发现，其在转录及转录后等多个层次发挥作用，调控基因的表达。近年来，关于lncRNA在肺纤维化中作用机制的研究逐渐增多［2］。为了进一步了解其在肺纤维化中的功能意义，为肺纤维化的预防及治疗提供参考，本文从lncRNA的角度出发，综述其在肺纤维化发生发展过程中的作用机制。

1 lncRNA参与肺纤维化的调控

上皮细胞间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞通过特定程序转化为具有间充质表型细胞的生物学过程，是肺纤维化发病机制中的重要进程。EMT发生时，肺泡上皮细胞受损，细胞失去极性，细胞原有的标志物丢失或下调表达，而间充质细胞标志物增多，导致细胞黏附能力减弱，细胞迁移性增加，细胞形态也发生改变，最终出现纤维化改变。目前EMT的发生机制比较清楚的是，在肺泡上皮细胞中，转化生长因子β1（transforming growing factor-β1，TGF-β1）通过激活果蝇母系抗头状蛋白（drosophilamothers against decapentaplegic protein，Smad）通路促进EMT过程。近年来，针对肺纤维化的表观遗传调控研究揭示了lncRNA在EMT过程中发挥重要作用。研究证实，lncRNA主要通过以下三种方式参与调控EMT进程：一是lncRNA在转录水平调控EMT相关基因和蛋白的表达；二是lncRNA参与EMT相关信号通路；三是lncRNA通过竞争性内源机制与miR⁃NA竞争性结合，从而影响miRNA下游与EMT相关基因的表达。

lncRNA在转录水平的调控主要是指lncRNA干扰信使RNA（messenger RNA，mRNA）的转录以及直接与蛋白结合，影响EMT相关蛋白的表达。Sun等［3］用博来霉素诱导小鼠产生肺纤维化，基因芯片检测转录组表达改变情况，发现博来霉素诱导的小鼠特发性肺纤维化模型中，513条lncRNA表达上调，204条表达下调。基因本体分析（GeneOntology analysis，GO分析）发现这些lncRNA的表达改变与肺泡上皮形态，细胞分化相关联，信号通路分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG分析）发现lncRNA的表达改变与EMT进程密切相关，不仅如此，作者还鉴定出2条lncRNA：uc.77和2700086A05Rik通过调干扰锌指E盒结合蛋白2（zinc finger E-box binding protein 2，Zeb2）和同源盒基因3（homeobtic gene3，Hoxa3）mRNA的表达而诱导肺上皮细胞产生EMT。He等［4］研究发现，lncRNA FEZF1-AS1在非小细胞肺癌细胞株上表达降低时，能抑制细胞EMT进程。机制研究表明，lncRNA FEZF1-AS1通过直接与组蛋白赖氨酸特异性去甲基酶1和组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶蛋白结合后抑制EMT的进程。

lncRNA能参与EMT相关信号通路，发挥对EMT的调控作用。Xiang等［5］针对lncRNA肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在EMT中的作用展开了研究，发现TGF-β1诱导血管内皮祖细胞产生EMT的过程中伴随着lncRNA MALAT1表达增高的现象，lncRNA MALAT1与miR-145结合后，引起下游重组人转化生长因子β受体2（recom⁃binant human transforming growth factor beta receptorⅡ，TGFBR2）和SMAD3基因表达改变，激活TGF-β1表达，从而起到促进EMT作用。研究者用二氧化硅染毒小鼠制作出肺纤维化模型，在动物和细胞实验中发现，lncRNA MALAT1通过竞争性结合miR-503，对下游与EMT进程密切相关的基因蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、哺乳动物西罗莫司（sirolimos，雷帕霉素）靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）、锌指转录因子Snail等的表达产生影响，从而促进二氧化硅诱导的肺纤维化发生发展［6］。Yang 等［7］研究了 lncRNA H19 在TGF-β1诱导的牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，MAC-T）EMT中的作用，发现其在牛乳房炎症组织和炎症性MAC-T细胞中高表达，其通过参与PI3K/AKT信号通路，促进TGF-β1介导的EMT进程。该研究小组还对lncRNA-ATB在EMT中的作用展开了研究，发现M2巨噬细胞分泌的TGF-β1能激活肺上皮细胞中的lncRNA-ATB表达升高，而且后者通过竞争性结合miR-200C对下游EMT相关基因Zeb1起调节作用，从而促进EMT过程［8］。以上信号通路研究说明，多个lncRNA可能参与同一EMT相关信号通路，如lncRNA MALAT1和lncRNA H19均能通过调节PI3K/AKT信号通路促进TGF-β1介导的EMT进程，但不同的lncRNA在同一信号通路中作用机制可能不同，如lncRNA MALAT1存在与miRNA的竞争性内源机制，而lncRNA H19在该研究中未显示与miRNA存在竞争性内源机制。

lncRNA通过竞争性内源机制与miRNA竞争性结合，从而影响miRNA下游与EMT相关基因的表达是目前EMT表观调控机制研究的内容。Song等［9］研究了lncRNA MRAK088388和MRAK081523在肺纤维化中的作用机制。结果发现，前者通过竞争性结合miR-29b调控下游。N4bp2表达，而后者通过竞争性结合let-7i-5p调控下游Plxna4表达。作者认为lncRNA在肺纤维化中促进EMT的作用机制与竞争性内源性结合miRNA相关。Liu等［10］运用基因芯片和生物信息学手段分析了TGF-β1诱导的肺上皮细胞EMT中mRNA，miRNA和lncRNA的表达改变情况，及三者的共表达网络，发现在EMT进程中，三者均出现表达改变，其中24条mRNA、11条miRNA和33条lncRNA能共表达且相互影响，但三者之间不存在竞争性内源机制。作者认为可能的解释是，生物在进化过程中发展出来很多复杂的机制，而竞争性内源机制学说可能仅起到调节作用而不能解释三者之间的共表达关系。该实验虽无发现竞争性内源机制，但在肺纤维化的EMT进程中作用不可忽视，今后需要更多实验证据支撑lncRNA的竞争性内源机制学说在EMT中所起的作用。

2 lncRNA参与肺纤维化的炎性-免疫反应

肺泡上皮细胞是肺部抵御外界侵害和感染的第一道屏障，主要有2类细胞组成，包括90%的Ⅰ型细胞和10%的Ⅱ型细胞。炎症-免疫反应是肺纤维化的病理基础过程。初期肺泡上皮细胞损伤，产生炎症反应，细胞结构和膜蛋白调节改变，上皮黏附分子异常表达，细胞因子及其他蛋白酶等分泌增多，炎症和异常修复导致肺间充质细胞增殖，产生大量的胶原和细胞外基质。随着炎性-免疫反应的进展，免疫系统对外界刺激因素或细胞因子等进行非特异或特异性识别以及清除，肺泡壁、气道和血管最终发生不可逆的肺部纤维化。从lncRNA的角度深入了解肺炎症-免疫反应对肺纤维化的贡献，有助于揭示肺纤维化的部分机制。Dai等［11］采用大鼠肺损伤模型研究lncRNA MALAT1在肺泡上皮细胞损伤中的作用，发现lncRNA MALAT1可激活脂多糖诱导的炎症反应通路以及促进脂多糖诱导的肺损伤进程，且通过竞争性结合miRNA-146a的机制发挥促进细胞损伤的作用。

lncRNA通过调控炎性相关因子表达参与炎症反应过程，从而对肺纤维化炎症发生发展进程产生影响。Wang等［12］运用机械通风诱导的小鼠肺损伤和肺纤维化模型，发现332条lncRNA表达出现改变，GO分析发现，表达改变的lncRNA功能富集在细胞炎症反应和纤维化上；KEGG分析发现，lncRNA可能通过Wnt、缺氧诱导因子和Toll样受体等免疫反应通路介导纤维化进程。已知长期吸入香烟烟雾与肺纤维化发病明显相关，Liu等［13］发现，香烟烟雾诱导人支气管上皮细胞出现纤维化，lncRNA HOTAIR和炎症分子白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）表达改变。ChIP实验证实，lncRNA HOTAIR能直接和转录因子结合，阻断IL-6炎症因子后，STAT3表达下调，lncRNA HOTAIR过表达，说明肺纤维化中的炎症因子IL-6能通过STAT3信号通路上调lncRNA HOTAIR的表达，对肺纤维化的发生发展产生作用。Huang等［14］对PM2.5颗粒物引起肺纤维化的机制展开研究，发现PM2.5处理人支气管上皮细胞后，lncRNA MALAT1表达改变与纤维化进程呈现相关性，lncRNA MALAT1升高的程度与炎症因子IL-6和IL-8表达升高也呈现一致性，说明lncRNA MALAT1通过调控炎症因子参与PM2.5诱导的肺纤维化过程。

lncRNA BGas通过调控免疫反应相关蛋白表达，参与肺纤维化免疫反应。Duru等［15］在辐射诱导肺纤维化的综述中指出，辐射诱导肺纤维化的发生与巨噬细胞极化、免疫调控以及lncRNA之间关系密切。C57B/6小鼠接受辐照后，lncRNA LIRR1和lncRNA LIRR5表达升高，而lncRNA LIRR2，3和4表达降低。进一步针对lncRNA LIRR1展开研究，发现支气管上皮细胞株BEAS3B经辐照后，lncRNA LIRR1在此细胞株上表达升高，细胞进入G1期的数量增多，DNA修复蛋白如KU抗原和70 ku亚单位（70 ku subunit of KU antigen，KU70）表达下降。结果说明在辐射诱导肺纤维化过程中，lncRNA LIRR1介导辐射后细胞的DNA损伤免疫反应。Balloy等［16］用铜绿色假单胞菌（绿脓杆菌）感染原代囊性纤维化患者的肺上皮细胞和正常人上皮细胞，对比分析2组之间转录组情况，发现lncRNA转录水平在该菌感染原代囊性纤维化患者的肺上皮细胞中显著改变，GO分析发现改变表达的lncRNA与囊性纤维化的炎症反应通路密切相关，其中lncRNA LINC00862和lncRNA CTD-2619J13在上皮细胞感染的0，2，4和6 h均表达上调，可作为囊性纤维化的标志物。Saayman等［17］鉴定发现了一条与囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis trans⁃membrane conductance regulator，CFTR）有关的lncRNA BGas，发现其过表达时，CFTR功能受抑制，反之，采用siRNA技术沉默lncRNA BGas后，CFTR活性激活。采用生物素标记寡核苷酸实验发现，lncRNA BGas能与高迁移率族蛋白14多克隆抗体、人高速泳动蛋白17和高迁移率族蛋白B1抗体及重组人良性的神经细胞肿瘤同系物（within BGCN homolog）蛋白等几种在肺纤维化进程中调节炎症-免疫反应的蛋白结合，调控这些蛋白的表达。曹国红等［18］通过观察博霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中lncRNA表达谱的变化，探讨lncRNA在肺纤维化中的调控机制。结果发现，表达上调的lncRNA 210个，表达下调358个，GO分析及KEGG分析发现，发生变化的lncRNA在生物学功能上主要涉及免疫反应，参与的信号通路主要有细胞因子与细胞因子受体相互作用、趋化因子信号转导通路、Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号通路和过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路等［19］。

3 lncRNA参与肺纤维化的凋亡过程

细胞凋亡是细胞程序性死亡的方式，与肺纤维化发生发展密切相关。细胞凋亡涉及一系列蛋白的激活、表达以及调控的作用，其中，胱天蛋白酶家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、P53蛋白以及某些受体扮演重要角色。常见细胞凋亡通路有线粒体通路、细胞膜通路以及内质网通路。细胞凋亡可刺激这3条通路的任何一条，也可激活多条通路，导致凋亡产生。目前研究发现肺泡上皮细胞凋亡是导致肺纤维化形成的主要原因。细胞凋亡增多直接导致肺泡塌陷，加速肺纤维化进程。

lncRNA通过调控凋亡相关蛋白或通路参与凋亡过程。Gao等［20］对比分析了特发性纤维化患者和正常对照组外周血样本lncRNA TERRA的表达，发现其在特发性纤维化患者外周血中显著升高，当其被siRNA干扰沉默后，可改善线粒体相关细胞周期E基因，如基质金属蛋白酶，Bcl-2家族基因，增强线粒体功能，同时增强凋亡相关蛋白的表达，如细胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3等。研究表明，lncRNA TERRA通过调节凋亡蛋白以及调控线粒体功能，从而对纤维化发生发展产生作用。Du等［21］研究对比分析24例特发性肺纤维化和配对24例正常人外周血中lncRNA的表达差异谱，发现440个lncRNA上调，1376个lncRNA下调。生物信息学发现，其中1个lncRNA CDKN2B-AS1的表达下调能激活P53信号通路，促进肺癌的发生，说明在特发性肺纤维化患者中，肺癌的发生与lncRNA表达改变以及参与P53信号通路有关。Zhou等［22］研究了lncRNA-P21在肺纤维化中的作用，发现其低表达能激活HY3和H4在Thy-1启动子上的乙酰化反应，以及激活Thy-1的活性，从而诱导细胞凋亡增多，促进肺纤维化发生发展。

4 展望

lncRNA虽不编码蛋白质，但能与同源DNA序列或RNA序列结合，也能折叠成复杂的二级结构，与多种蛋白质结合，参与转录前调控，如lncRNA的部分区域与DNA结合，然后其他部分折叠成高级结构，再与表观因子结合，调控下游基因转录。lncRNA还可参与转录过程的调控以及转录后调控，发挥多种重要生物学功能。综上所述，在lncRNA与肺纤维化作用机制研究中，lncRNA主要通过某些信号通路或竞争性结合miRNA调控EMT进程、参与纤维化炎症-免疫反应、调控凋亡相关蛋白或通路参与凋亡过程等发挥影响肺纤维化的发生发展作用。lncRNA在肺纤维化作用机制的研究，为揭示肺纤维化的发病机制提供了新的思路，也为今后肺纤维化的诊断和治疗提供的有价值的生物学标志物和治疗干预靶点。但外界致肺纤维化因素的刺激、肺效应分子、多个信号通路、细胞因子和蛋白参与，使得lncRNA调控肺纤维化的机制构成了复杂的细胞-分子-通路-蛋白网络。目前，针对lncRNA在肺纤维化中的研究还处在起始阶段，很多机制还尚不清楚，如竞争性内源结合机制具体是如何发挥作用，lncRNA是否能参与内质网通路调控肺纤维化，lncRNA在转录前、转录中和转录后如何调控相关通路和基因。这些问题将引导我们继续lncRNA的研究，深入探究其在肺纤维化中所起的作用。