蒙医常用药狼毒对黑色素瘤治疗的研究进展△

董文静 李 明 董 武

(内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古 通辽 028000)

狼毒(Steller Chamaejasme)在中药中属于二级毒性药物而禁用，有瑞香科狼毒和大戟科狼毒。但是狼毒是蒙医上常见的有毒抗肿瘤蒙药[1]。狼毒能够治疗水肿腹胀、痰、食、虫积、心腹疼痛、慢性气管炎、咳嗽和气喘等症状，以及治疗淋巴结、皮肤、骨和副睾等部位的结核、疥癣和痔瘘等疾病。狼毒有很好的抗癌作用，但也具有一定的毒性，家畜误食后多表现为呕吐、腹泻、四肢无力和全身痉挛等急性中毒症状，严重时虚脱，甚至惊厥死亡，其中孕畜接触会导致流产，人接触时则会引起过敏性皮炎[2]。

随着人们的生活水平的提高，危害人类健康的癌症的发病率也不断增加，黑色素瘤是较常见的恶性肿瘤，近年来已经成为发病率增长最快的肿瘤之一，据世界卫生组织(WHO)报道，全球每年有132,000的人患有黑褐素瘤，而且预计还会持续增长[3]。黑色素瘤的发病率较高，并且在黑色素瘤第四期快速转移，手术效果不良，切除手术治疗应该慎重选择[4]。因此迫切需要寻找一种有效药物来治疗黑色素瘤。

有研究发现狼毒大戟提取液对小鼠体内恶性黑色素瘤B16细胞的生长有显著的抑制作用,能显著减缓肿瘤生长速度，狼毒能下调小鼠体内恶性黑色素瘤B16中Bcl-2/Bax凋亡蛋白的表达，预示凋亡细胞增加而让肿瘤增长减缓[5]。Catherine M. Scahil等[6]研究发现斑马鱼的kdm2aa基因的缺失能够导致高频率的黑色素瘤，并且黑色素瘤是一种发生于黑色素细胞的恶性肿瘤，临床研究发现在晚期黑色素瘤患者中发生了BRAF(V600E)的突变[7]，约50%的晚期黑色素瘤患者中有 BRAF( V600E) 突变，在一些研究中其突变率甚至高于 60%[8]。

1 狼毒化学成分

1.1 瑞香狼毒的化学成分 瑞香狼毒的化学成分复杂，60年代，我国学者就研究了狼毒的成分，而1982年Masaiake Niwa使用甲醇从瑞香狼毒中分离出瑞香烷型，即二萜成分,具有显著的抗癌活性[9]。瑞香狼毒中的主要化学成分有二萜类、双二氢黄酮类、香豆素类、木脂素和苯丙烯醇昔类等化合物。赵亮[10]通过液相色谱与质谱(GC-MS)研究瑞香狼毒提取液发现，其中化学成分含有黄酮类化合物，伞形花内酯及西瑞香素等香豆素类成分。其中黄酮类化合物含量较高，包括狼毒色原酮、狼毒素、异狼毒素、新狼毒素A、新狼毒素B和狼毒素C等双二氢黄酮类衍生物。

1.2 大戟科狼毒化学成分 大戟科狼毒有月腺大戟和狼毒大戟两类。熊爽[11]从月腺大戟根中分离得到了7种单体，分别是β-香树脂醇乙酸酯(β-amyrinacetat e)，24-亚甲基环阿 尔廷醇(24-methylene cycloartanol)，3,3′-二乙酰基-4，4′-二甲氧基-2，2′，6，6′-四羟基二苯甲烷(3，3′-diacetyl-4,4′-dimethoxy-2，2′，6，6′tetrahy-droxy-dipheny-lmethane)，岩大戟内酯B(jolkinolide B),狼毒乙素(2，4-dihydroxy6-methoxy-3-methy-1-acetoph-enone),月腺大戟甲素(ebractedatanolide A)和β-谷甾醇(β-sitosterol)。邓彬等[12]从月腺大戟(Euphorbia ebracteolata Hayata)植物根部分离得到8个化合物,分别是巨大戟二萜-3-肉豆蔻酸酯、巨大戟二萜-3-棕榈酸酯、9,19-环阿尔廷-23E-稀-3β,25-二醇、24-亚甲基环阿尔廷烷-3,28-二醇、β-香树酯醇乙酸酯、狼毒乙素、2,4-二羟基-6-甲氧基-3-醛基苯乙酮和月腺大戟素A。其中化合物巨大戟二萜-3-肉豆蔻酸酯、巨大戟二萜-3-棕榈酸酯、9,19-环阿尔廷-23E-稀-3β,25-二醇、24-亚甲基环阿尔廷烷-3,28-二醇均为首次从该植物中分离得到。而狼毒大戟化学成分主要为二萜、三萜、鞣质、甾醇、蒽醌类等化合物。李青松等[13]用乙醇冷浸提取方法萃取，从狼毒大戟的乙酸乙酯部位得到狼毒乙素、2，4-羟基-6-甲氧基苯乙酮、东莨菪亭、东莨菪苷、二十四烷酸、丁香酸、正丁醇部位得到蔗糖。其中从狼毒大戟中首次分离得到东莨菪苷、二十四烷酸，丁香酸，正丁醇部位得到蔗糖。孙增玉等[14]在狼毒大戟的氯仿部位分离得到7个化合物，分别为23(Z)-环阿尔廷-23-稀-3β,25-二醇、22(E)-环阿尔廷-22-稀-3β,25-二醇、Jolkinolide B、2,4-二羟基-6-甲氧基-3-醛基苯乙酮、β-香树脂醇乙酸酯、Antiquorin、二十四亚甲基环阿尔廷醇，其中二十四亚甲基环阿尔廷醇为首次从绿玉树中分离得到。

2 狼毒抗肿瘤机理

段昕等[15]研究发现，瑞香狼毒总黄酮提取物明显抑制人肺癌细胞A549细胞的增殖，并且随着浓度的增加细胞的抑制率也增强。总黄酮提取物可诱导A549细胞细胞凋亡 ,并将细胞阻滞在G1 期。王蒙等[16]研究发现，狼毒大戟中松香烷型二萜内酯类化合物能够抑制肝癌HepG-2、乳腺癌MCF-7、宫颈癌Hela、胃癌SGC-7901、BGC-823、MGC-80细胞的增殖。其中松香烷型二萜内酯类化合物jolkinolideB、17-hydroxyjolkinolide B对肝癌细胞的增殖有一定的抑制作用，jolkinolide A-、jolkinolideB、17-hy droxyjolki nolide B对乳腺癌细胞增殖有一定的抑制作用，jolkinolideB ，对胃癌BGC-823、MGC-803细胞的增殖有一定的抑制作用，17-hydroxyjolkinolide B对胃癌SGC-7901、MGC-803细胞的增殖有一定的抑制作用。jolkinolideB、17-hydroxyjolkinolide B对宫颈癌细胞的增殖有一定的抑制作用。王莉萍等[17]研究发现，狼毒提取液能够下调抗细胞凋亡Bcl-2蛋白和上调促细胞凋亡Bax蛋白的表达、降低 Bcl-2 /Bax 蛋白比率，可能是狼毒提取液诱导肿瘤细胞凋亡、抑制恶性黑色素瘤 B16 细胞生长关联的基因表达。王园园等[18]通过体内和体外实验发现狼毒大戟提取液能够抑制小鼠恶性黑色素瘤细胞B16生长和转移，并且诱导小鼠恶性黑色素瘤细胞B16凋亡。通过上调PTEN蛋白表达并下调p-Akt蛋白的表达，降低、p-Akt、MMP-2及P70S6K1及基因含量，调控PI3K/Akt信号通路活化，抑制小鼠恶性黑色素瘤细胞B16的生长和转移。通过腹腔注射狼毒大戟提取液发现可显著抑制小鼠细胞移植瘤生长及降低肺转移发生率，可上调B16小鼠移植瘤中的PTEN表达并下调p-Akt表达。最近周昕欣等[19-20]，通过抑制Bcl-2mRNA表达，增加Caspase3和Caspase9m RNA表达而诱导细胞凋亡而达到抑制癌细胞增长。由此可见狼毒提取液的肿瘤抑制作用有可能是通过激活细胞凋亡路径或者活化PI3K/Akt信号通路。

3 黑色素瘤模型以及治疗前沿

3.1 小鼠黑色素瘤模型的制作以及治疗 小鼠作为黑色素瘤模型被广泛应用，更加便于对黑色素瘤的治疗研究。Perez-Torres, A.等[21]在母鼠侧尾静脉中转移2105 数量的B16-f0黑素瘤细胞，1周后在皮下注射GK1肽，在外周血液中的INF显著减少，淋巴细胞与对照组相比也有显著的降低。延迟了肿瘤的生长，并增加了肿瘤细胞的内部坏死。通过进一步的研究来阐明GK1肽对黑素瘤的确切作用机制，以及它们最终在人类身上的应用。

3.2 斑马鱼黑色素瘤模型的制作以及治疗 斑马鱼(Danio rerio)已经被确立为癌症研究最重要的模型生物之一[22]，如皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病、神经胶质瘤和肺癌等[23-27]。斑马鱼黑色素瘤模型的发展，使我们能够更好地了解肿瘤的病理机制，并有可能进行毒物筛选和药物开发。KDM2A是一种与转录沉默有关的组蛋白，但是它对器官和疾病的作用却很少有人知道。Kdm2aa在调节正常的mRNA水平和致癌作用方面，扮演着复杂的角色，当斑马鱼体内缺失kdm2aa序列会导致RNA转录被阻断，有更高频率黑色素瘤诱发。研究表明kdm2aa突变体是黑素瘤的第一个单基因淘汰模型[6]。众所周知，肿瘤能够诱导血管的生成，肿瘤血管生成多寡也预示癌症治疗结果的指标。斑马鱼肿瘤异种移植,在研究肿瘤血管生成方面是一个新兴工具，通过斑马鱼肿瘤模型来快速、简单、定量的来量化肿瘤血管生成[27]。Le X.等[28]将斑马鱼mitfa启动子与人类致癌HRASG12V耦合制作黑色素瘤斑马鱼模型。通过某些基因敲除技术，以及给斑马鱼体内注射移植黑色素瘤细胞，制作斑马鱼黑色素瘤模型，来评价药物的治疗作用，得到非常成功的模型。

如今治疗黑色素瘤的方式主要通过手术切除，治疗药物比较单一，8种FDA批准的药物在我国也均未上市[29]。通过小鼠和斑马鱼黑色素模型，蒙药狼毒提取物对黑色素瘤有良好的治疗效果，但有关具体成分，治疗机制还有必要进一步研究。我们使用人黑色素瘤细胞A2058细胞系，探讨醋炮制狼毒提取液对黑色素瘤细胞的抑制作用，发现提取液能够显著杀死黑色素瘤细胞，使用斑马鱼胚胎作为实验动物模型，发现不同炮制狼毒提取液(酸奶、诃子、醋、酒精和牛奶)能够强烈诱导斑马鱼鳍细胞凋亡，高浓度可引起尾部组织的组织缺失[30]。使用斑马鱼胚胎作为模型，向斑马鱼胚胎注射人黑色素瘤细胞，然后使用狼毒提取液进行处理，以探讨有关狼毒提取液的作用效果以及作用机制。

狼毒有抑制黑色素瘤生长的作用，但其成分，作用机理还有待进一步研究。斑马鱼胚胎作为黑色素瘤模型，具有潜在的应用价值，可以评价狼毒以及其他抗肿瘤药物，具有廉价、敏感、容易观察等众多优点，建议在此方向有更多深入研究。

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