无菌试管苗安全高效接种技术规程

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(达州市农业科学研究院，　四川 达州 635000)

组培接种是一项技术性较强的工作，每一个操作细节都将会影响接种效果。实践证明，接种技术不科学，接种操作不规范是组培生产中的最大污染来源。在多年的组培接种繁育实践工作，总结出了一套无菌试管苗安全高效接种技术，操作规范、接种安全，而且试管苗污染率低，接种效率高、管理科学规范，效果非常明显。

1　接种准备

1.1接种室提前用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒(每立方米用40%甲醛10 mL倒入装有高锰酸钾5 g的容器内)；并强制过滤通风[1]。

1.2用香皂或洗手液将手洗净，更换工作服、鞋、防尘帽、口罩。用75%酒精或0.5%苯酚对超净工作台喷雾降尘消毒，接通超净工作台电源，打开电源开关、风机，打开紫外灯照射15～30 min[2]。

1.3准备好消毒灭菌药物、接种用苗、接种培养基、接种工具、酒精灯(在超净工作台外用漏斗添加酒精至1/2～2/3)。

1.4关闭紫外灯，打开照明灯。

1.5用75%的酒精消毒双手、用75%酒精棉(棉球不能太大、酒精不能太多)擦拭超净工作台的台面和侧壁以及放在超净工作台中的所有器具，将棉球及时移出超净工作台，稍后点燃酒精灯[3]。

1.6将镊子、剪刀、解剖刀等接种用器具在酒精灯火焰外焰上(不能太靠近酒精灯灯芯)进行灼烧灭菌：从头至尾过火数遍，然后反复过火尖端处(不得少于5 s)，然后摆放好让其自然冷却。

1.7将灭好菌的无菌滤纸在超净工作台外褪去外包装袋，在超净工作台上小心地打开包装报纸，用无菌镊子将无菌滤纸取出放在离风窗10～20 cm(不可太往外)。去除第1张滤纸。将接种镊子进行再次灼烧灭菌，然后摆放好冷却待用。

2　转接苗

2.1　取　苗

在酒精灯火焰上方打开培养瓶的瓶盖/封口膜，瓶口对准酒精灯火焰外焰旋烤7～10 s，然后开始取苗，将取出的苗子放在无菌滤纸上。取苗时，瓶口不要斜向外；如果不能一次取出全部材料，要先把封口膜(瓶盖)对着风源放在酒精灯的左前方，取苗后及时盖上。

2.2　切　苗

用镊子和剪刀将植物材料在无菌滤纸上进行剪切，要求快速准确。将苗子切成带1～2个叶片和腋芽的节段接种于培养基上[4]，在操作过程中，剪刀和镊子都要在无菌滤纸斜上方操作，不可在其正上方操作。

2.3　接　苗

在酒精灯火焰上前方打开培养瓶的瓶盖(封口膜)，封口膜放在酒精灯的左前方，将瓶口对准酒精灯火焰外焰旋烤7～10 s，烤完瓶口后，在酒精灯火焰前上方用镊子将接种材料接种到新的培养基上，接完后瓶口对准酒精灯火焰外焰再次旋烤，然后及时封上封口膜[5]。接苗时，镊子最好不要与瓶口接触；组培苗在瓶内要排放整齐、均匀、美观。

注意： 1) 接种过程中动作要小心谨慎，以防将酒精瓶或酒精灯碰倒碰翻；严禁将棉球点燃后置于酒精灯或酒精瓶下及附近；用后的棉球要及时移出超净工作台；严禁将有明火或过烫的接种工具放入酒精瓶。万一发生意外，应及时用灭火器扑灭[6]。 2) 转接苗时，双手不能离开超净工作台，接种过程中不宜说话，出大气，咳嗽。 3) 接种过程中手不能经过滤纸上方；接种工具不能移出超净工作台。 4) 接种过程中要随时对手进行消毒，镊子和接种刀要随时灼烧灭菌并冷却待用，不可太热。 5) 每接完1瓶要换1次滤纸，对接种工具消1次毒。 6) 接种后要及时标记：把品种代号、培养基类型、接种日期、个人编号标示到瓶上。

3　接种收尾

3.1用酒精灯帽盖灭酒精灯(严禁用嘴吹灭)。

3.2把接种过程中产生的垃圾清理掉，把工作台收拾干净，台上的物品摆放整齐。

3.3关闭风机、照明灯、电源开关，断开电源。

3.4将瓶苗整齐有序地摆放在培养架上。

3.5将垃圾及其它物品带出接种室。

3.6做好接种工作记录。

参考文献：

[1]孟长军.组培实验室常见消毒方法优劣比较[J].中国园艺文摘,2012(8):177-179.

[2]秦晓萍.马铃薯脱毒苗组培快繁技术[J].中国种业,2015(4):81-83.

[3]朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌[J].植物生理学通讯,1996,32(6):444-449.

[4]赵佐敏,艾勇.马铃薯组培脱毒试管苗繁育技术[J].中国马铃薯,2003,17(5):301-304.

[5]辛国斌.脱毒马铃薯实验室扩繁技术的改进与应用[J].中国马铃薯,2002,16(4):239-240.

[6]刘进平,莫饶,吴繁花.组培工厂及植物组织培养实验室的安全管理[J].农业与技术2005,25(1):125-129.

(本栏目责任编辑：申晓、陈婉莹)