寻常性银屑病患者表皮中DNA甲基化转移酶2和3amRNA的表达

毛旭华 栾超 胡煜 董卉妍 蒋明军 陈敏

214200江苏，宜兴市人民医院检验科（毛旭华）；中国医学科学院 北京协和医学院皮肤病研究所（栾超、胡煜、蒋明军、陈敏）；徐州医科大学（董卉妍）

近年研究发现，DNA甲基化异常在银屑病发病机制中起一定作用。DNA甲基化转移酶（DNMT）是一类在DNA甲基化过程中起重要调控作用的酶，在真核生物中它分为3个家族，即DNMT1、DNMT2和DNMT3。DNMT1在银屑病皮损中异常表达［1］，而DNMT2和DNMT3a在胃癌组织中均有异常表达［2］。本研究采用实时定量PCR技术检测银屑病患者表皮中DNMT2和DNMT3a的表达，探讨DNMT2和DNMT3a与银屑病发病机制的关系。

一、资料和方法

1.临床资料：入选标准：寻常性斑块状银屑病患者，年龄18～65岁，4周内未系统用药物，2周内未外用药物，不伴感染、其他自身免疫性疾病及肿瘤。46例银屑病患者来自2009年3月至2010年12月中国医学科学院皮肤病医院皮肤科及宜兴市人民医院皮肤科门诊。全部为苏皖地区汉族人。男33例，女13例；年龄18～65岁，病程1～30年，银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）5.1～46.2。25例为进行期，21例为稳定期。46例患者同时采集皮损及周围外观正常皮肤。28例对照组标本来自中国医学科学院皮肤病医院皮肤外科美容手术切除的苏皖地区健康汉族人正常皮肤，男21例，女7例。银屑病组和对照组间年龄和性别分布差异无统计学意义（均P＞0.05）。本研究已获中国医学科学院皮肤病医院和宜兴市人民医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

2.主要试剂和仪器：分散酶（美国Roche公司），RNA提取和纯化试剂盒（美国Qiagen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），Hot Taq DNA聚合酶（美国Promega公司）。引物由南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司合成，其序列为：DNMT2正向引物 5′⁃AAGCTGTAAGCCAGCCCATATA⁃3′，反向5′⁃TCAGCAGTGAACAGAACCTACATG⁃3′，片段长度148 bp；DNMT3a正向引物5′⁃TTCTACCGCCTCCTGCATGAT ⁃3′，反向5′⁃GCGAGATGTCCCTCTTGTCACTA ⁃3′，片段长度113 bp；内参照β肌动蛋白正向引物5′⁃CAGTCGGTTGGAGC GAGCAT ⁃3′，反向5′⁃GGACTTCCTGTAACAACGCATCT ⁃3′，片段长度112 bp。ABI7500实时定量PCR仪为美国ABI公司产品。

3.标本采集和真表皮分离：用6mm环钻分别钻取银屑病患者皮损和皮损边缘3 cm外的正常皮肤（非皮损），置-80℃冰箱中保存备用。0.25%分散酶消化患者及对照皮肤标本16～20 h，分离出表皮，置于用焦碳酸二乙酯水处理过的玻璃研磨器中匀浆化。

4.实时定量PCR检测皮肤组织中DNMT2和DNMT3a mRNA：取匀浆按照Qiagen公司说明书提取总RNA，检测RNA的含量和纯度。按照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。产物置-20℃保存待PCR扩增。实时定量PCR扩增反应体系包括2倍RTmix 12.5μl，模板（cDNA稀释10倍）2μl（0.2μmol/L），2μmol/L正向和反向引物各2.5μl，加无核酸酶水至25μl。短暂离心后上样，每个样本做3个复孔。反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。熔解曲线分析：温度60℃～95℃，温度间隔0.3℃，时间为5 s。ΔCt为目的基因与内参基因的Ct差值。通过2⁃ΔΔCt将mRNA表达数据转化为线性形式进行统计分析。

5.统计学分析：采用SPSS 11.5软件包进行统计分析，组间比较采用独立样本t检验，显著性检验水平为0.05。

二、结果

1.表皮DNMT2mRNA的表达：银屑病组与对照组表皮均检测出DNMT2 mRNA表达。皮损、非皮损和对照组DNMT2mRNA表达水平（2⁃ΔΔCt值）分别是0.62 ± 0.02、0.36 ±0.05和0.15±0.11，皮损组明显高于非皮损组（t=6.23，P＜0.01），非皮损组明显高于对照组（t=7.33，P＜0.01）。

2.表皮DNMT3amRNA的表达：银屑病组与对照组表皮均检测出DNMT3amRNA表达。患者皮损、非皮损和对照组表皮中 DNMT3amRNA 表达水平（2⁃ΔΔCt值）分别是 0.85 ±0.03、0.43±0.04和0.18±0.09，皮损组明显高于非皮损组（t=5.66，P ＜0.01），非皮损组明显高于对照组（t=8.62，P ＜0.01）。

三、讨论

我们曾在银屑病皮损中发现，P16基因启动子区域甲基化异常，50%启动子CPG岛发生甲基化改变［3］。在银屑病患者皮肤中，甲基化转移酶DNMT1和MeCP2均存在异常表达［1］，HLA I类分子C位点启动子区域甲基化异常［4］。

本研究发现，银屑病患者皮损表皮中DNMT2和DNMT3amRNA表达明显高于非皮损表皮，且非皮损表皮又高于正常对照组。而之前的研究发现，银屑病皮损中DNMT1mRNA的表达低于正常对照组，而另一种重要的DNA甲基化酶MeCP2mRNA的表达高于正常对照组［1］。有报道银屑病患者外周血单一核细胞中DNMT1高表达，MeCP2 低表达，未发现DNMT3a和DNMT3b异常表达［5］。由此推断，银屑病患者皮损与外周血中各甲基化相关基因的表达并不一致。