酶联免疫试剂盒检测鸡肉呋喃唑酮代谢物

赵敬翠

（辽宁省朝阳市建平县畜产品安全监察所122400）

呋喃唑酮是人工合成的硝基呋喃类抗菌药物，属于广谱抗菌药，对常见的革兰氏阴性菌 （大肠杆菌、沙门氏菌）和阳性菌有抑制作用，对真菌、原虫等也有很好的杀灭效果，可用于治疗细菌和原虫引起的痢疾、肠炎、胃溃疡等胃肠道疾患。呋喃唑酮进入动物体内很快被分解，其代谢物有致癌、致畸等作用。中华人民共和国农业部将呋喃唑酮列为禁止使用的药物，不得在动物性食品中检出。FDA也于2002年禁止了硝基呋喃类 (包括呋喃唑酮)在动物性食品中的使用。

目前建平县区常用酶联免疫吸附法来检测鸡肉中呋喃唑酮代谢物。本文用酶联免疫试剂盒检测鸡肉中呋喃唑酮代谢物的含量，其原理是待测样品中的呋喃唑酮代谢物经衍生化后与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，当样品中呋喃唑酮代谢物含量少时，更多的抗体就会与酶标板上的抗原结合而被固定在酶标板上，加入酶标记物，催化底物显色，颜色为深蓝色；反之，含量多时，颜色为浅蓝色。

1 实验材料准备

1.1 样品前处理

在建平县屠宰厂随机抽取代表性样品 （鸡肉）40批次，每个样品取鸡腿部肌肉，精确秤取1±0.01g，均质后的样品于50ml离心管中；依次加入4ml去离子水、0.5ml1M盐酸和80μl50mM邻硝基苯甲醛，充分涡动1min至组织充分分散；衍生化1.5h；依次加入5ml缓冲溶液、400μl1M氢氧化钠和6ml乙酸乙酯，剧烈涡动1min，4000g以上离心 10min，取 3ml上清液于新的离心管中，50～60℃水浴中，氮气吹干；加入1ml正己烷，再加入1ml样品稀释液，高速涡动30s，4000g以上离心5min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质或小心吸取下层清液500μl于干净离心管中；取 50μl进行检测。

1.2 试剂盒及回温

呋喃唑酮代谢物酶联免疫试剂盒（II型）购自北京维德维康生物技术有限公司生产。实验前将试剂盒放于室内恢复至室温23～27℃。

1.3 阳性对照品的制备

根据标准曲线确定阳性对照浓度为0.2ppb， 取浓度0.81ppb标准品247.0μl添加到1g空白样品中，成为浓度0.2ppb的阳性对照品，用于计算阳性对照回收率。前处理同前。

2 检测步骤

（1）取出酶标板，做双孔平行，记录标准品、阳性对照品和样品的位置。

（2）在酶标板孔依次加入标准品、阳性对照品、阴性对照品和其它待测样品均为50μl。添加不同样品时需更换枪头，防止交叉污染。

（3）每孔加入50μl酶标记物工作液，再每孔加入50μl抗体工作液，用盖板膜盖好酶标板，轻轻振荡酶标板10s，避光反应30min。

（4）洗板严格按照说明书要求操作。

（5）洗板后拍干，立即在每孔中加入100μl底物A、B混合液。用盖板膜盖好酶标板，轻轻振荡酶标板，避光反应 15～20min。

（6）揭开盖板膜，每孔中加入50μl终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀。5min内，用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值，并将数值打印出来。

3 计算阳性对照回收率

利用电脑上r-biopharm数据分析软件进行结果分析，同时绘制标准曲线并得出所有检测样品中呋喃唑酮代谢物的含量。回收率 （%）=（实测阳性对照浓度-实测阴性对照浓度）÷添加浓度 （0.2ppb）×100%，本次检测回收率为95%，在75～105%范围内，说明此次检测和结果准确性高。

4 讨论

试剂盒要求贮存温度为2～8℃，因为抗体和酶标Ⅱ抗在常温下易变性。

加样时移液枪应垂直于板孔，防止将液体加在孔壁上部，加不同样品时要注意更换枪头，避免交叉污染。

洗板是很关键的一步。洗涤次数和每次加液量及间隔时间都要严格按照说明书要求操作，使游离的与结合的酶标记物的达到分离目的，确保实验结果的准确性。

底物A、B混合液严格按1：1比例充分混合，必须在5min内使用，不能使用金属盛装、搅拌试剂。

目前，酶联免疫吸附法是我们检测药物残留的常用方法之一。此方法具有方便、快速、灵敏等特点，适用于大批量样品筛查。