实时荧光定量PCR检测产琥珀酸丝状杆菌数量方法的研究

王国泽，刘达玉，余华，郭秀兰，左福元，朱智

（1.西南大学，重庆402460；2.成都大学药学与生物工程学院，四川成都610106）

纤维素是植物细胞壁的主要成分，广泛存在自然界，被视为极具潜质且最廉价的生物可再生能源[1]。在纤维素降解方面国内外已进行了多项研究，其微生物降解是较受关注的研究之一[2]。纤维素降解菌消耗纤维素并维持自身生长，同时将纤维素转化为具有利用价值的能源物质，这类降解菌主要包括真菌、细菌、放线菌[3-4]，而部分纤维降解菌属于严格厌氧菌如黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌等[5]，产琥珀酸丝状杆菌纤维分解活性很高，在反刍家畜瘤胃内大量存在，传统分离培养法很难对这种微生物进行定性和定量研究，因此，能否有效分离提取并确定其数量，对纤维素转化为可再生能源研究应用具有重要影响。

实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、反应迅速、定量准确等特点[6]，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光标记探针或荧光结合染料，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程[7]，目前已被广泛应用于生物食品及医学研究等领域，成为分子生物学中研究基因表达的常用方法[8]。迄今，关于利用实时荧光定量PCR方法对霍乱弧菌[9]、大肠杆菌[10]、沙门氏菌[11]等已有相关研究报道，但利用本方法对厌氧型纤维降解菌产琥珀酸丝状杆菌的定性定量相关研究较少，从而制约了其进一步开发利用。本试验通过提取瘤胃液细菌脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA），利用SYBR Premix Ex Taq荧光染料嵌合法和人工合成基因技术对产琥珀酸进行绝对定量，以期建立优化实时荧光定量PCR技术对纤维降解菌测定的体系方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山羊瘤胃液：西南大学牧场；型号为DP302细菌基因组DNA试剂盒：天根生化科技（北京）；TaKaRa Code.9160EASY Dilution、SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa Code.RR820A）、DNA标准品：宝生物工程（大连）有限公司。

Centrifuge 5804R高速台式离心机：艾本德中国有限公司；Nano Drop ND-1000紫外分光光度仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统：美国伯乐公司；TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa Code.TP600）、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time System（TaKaRa Code.TP800）：宝生物工程（大连）有限公司；水浴槽：厦门迈凯伦精瑞科仪有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取瘤胃细菌基因组DNA

将山羊瘤胃液通过4层纱布过滤，将滤液分装于5 mL离心管中，取滤液1.5 mL，采用细菌基因组DNA试剂盒法[5]提取细菌基因组DNA，提取后取1用琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度，用TE缓冲液（Tris-EDTA buffer solution）将所有样品标定至100 ng，保存于-20℃待用。

1.2.2 制作标准曲线

PCR扩增引物序列通过在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中进行比对，确定引物和探针的理论特异性，序列见表1，由大连宝生物公司合成提供。

表1 产琥珀酸丝状杆菌引物序列Table 1 The Fibrobacter succinogenes’Primer sequence

DNA标准品采用人工合成基因方法构建提供。用EASY Dilution将构建的DNA标准品梯度稀释（5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL）作为模板进行Real Time PCR反应，制作标准曲线。

1.2.3 建立并优化Real Time PCR检测体系

采用25uL反应体系进行实时定量PCR检测，其中 SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plμs）为 12.5，上下游引物各1，模板为2，dH2O为8.5。反应条件为95℃变性30 s；95℃5 s，62℃30 s，40个循环。数据分析参考Morisset D等[12]。

2 结果与分析

2.1 细菌总DNA提取效果

将用细菌基因组DNA试剂盒提取得到的15份瘤胃液细菌基因组DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。

图1 瘤胃液细菌基因组DNA样品普通电泳图Fig.1 Rumen fluid’s bacterial DNA ordinary electrophoresis

由图 1可知 M-1为Marker，标为标准品（10ng/μL），图中对应上表序列1-15为原液上样2 μL，电泳结果条带清晰，可满足后期试验需要。

2.2 产琥珀酸丝状杆菌DNA标准品荧光定量标准曲线的建立

2.2.1 扩增动力学曲线

将产琥珀酸丝状杆菌DNA标准品质粒以5×100的10倍倍比进行一系列稀释，结果见图2。由图2可知，DNA 标品在 5×100～5×108之间，曲线呈 S 型，具有较好的线性关系，表明构建的质粒DNA标准品可以得到较好的扩增曲线。

2.2.2 溶解曲线和标准曲线结果

产琥珀酸丝状杆菌标准品溶解曲线见图3。

图2 产琥珀酸丝状杆菌标准品扩增曲线Fig.2 Amplification curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

图3 产琥珀酸丝状杆菌标准品溶解曲线Fig.3 Solubility curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

从图3中可以看出，温度在86.5℃时，所有标品峰值达到最高，且溶解曲线峰形单一，表明构建的质粒DNA标准品纯度高，符合试验需要。产琥珀酸丝状杆菌标准品标准曲线见图4。

图4 产琥珀酸丝状杆菌标准品标准曲线Fig.4 Standard curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

从图4中可知，横坐标为质粒DNA梯度稀释对应拷贝数的对数值（Initial Quantity），纵坐标为达到荧光域值所需的阈值循环数（2ndDerivatitive Max，Ct），构建的质粒 DNA 标准曲线为：y=-3.478LOG（X）+37.40，相关系数为R2=1，标准曲线斜率为-3.47，结果表明构建的标准曲线和质粒DNA标准品能够满足后续绝对定量需要。

2.3 样品DNA的Real Time PCR检测结果

样品DNA的扩增曲线和溶解曲线见图5。

图5 样品DNA的扩增曲线和溶解曲线Fig.5 Solubility curves and amplification curves of DNA samples

由图5可知，15种DNA样品的溶解曲线均为单峰，且溶解温度在86.5℃左右，说明扩增产物单一，参考设计的引物具有较高的特异性。所有样品的扩增曲线呈S型，出现特异性扩增，扩增效率较高（93.9%），表明本试验反应条件及参数设定合理，本方法特异性良好。因此，通过荧光定量PCR扩增仪自动记录结果与构建的标准曲线结合，可计算出样品中产琥珀酸丝状杆菌的数量。

3 讨论

纤维素是反刍动物主要的饲料来源，细菌和真菌在分解利用纤维素过程中起主要作用，其纤维分解菌扮演重要角色[13]，琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是瘤胃内纤维素和半纤维素的主要消化细菌[14-15]。产琥珀酸丝状杆菌为革兰氏阴性菌，不运动，纤维分解活性很高，是瘤胃纤维分解菌的优势菌株之一，其纯培养菌降解结构性坚韧物质（如秸秆）能力很强，可降解两种瘤胃球菌所不能降解的某些同质异晶体纤维素，成为研究纤维素酶最早的瘤胃菌株之一[16]。王梦芝等[17]研究表明，产琥珀酸丝状杆菌产生的酶有独立的纤维催化区和纤维素结合区，具有很强的纤维降解能力，并且能够降解一些黄色瘤胃球菌与白色瘤胃球菌所不能降解的纤维素，在纤维素分解中占主导地位。因此，充分挖掘利用琥珀酸丝状杆菌的纤维降解能力，能够将自然界中具有利用价值的纤维素物质进行生物转化，转变为可被人们利用的能源物质。

实时荧光定量PCR技术克服传统计数方法中培养基选择局限、厌氧影响等因素，能够检测到微生物数量低于1%的细菌[18]，利用SYBR Green染料或Taq－Man探针对荧光信号积累情况实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[19]，目前该项技术已广泛应用于肠道微生物菌群的研究中。唐吉思等[20]根据牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因（sea），建立了seaDNA的SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测方法，其标准曲线的相关系数为0.99。杜雄伟等[11]针对沙门氏菌invA基因设计特异引物，建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法，结果特异性良好，组间组内重复性良好。谭翰清等[21]利用克罗诺杆菌MMS基因高保守序列，设计特异引物和Taq-Man-MGB探针，试验结果显示，构建方法线性关系良好，相关系数r2=0.999，扩增效率为99.972%。本试验采用荧光染料SYBR Premix Ex Taq与DNA结合，采用线性化质粒所构建的产琥珀酸丝状杆菌标准品制作标准曲线，试验结果标准曲线线性关系为R2=1，DNA样品试验结果溶解曲线峰值单一，扩增曲线呈S型，扩增效率为93.9%，线性关系良好。以上结果表明，本研究方法可有效测定瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌的数量。

4 结论

采用细菌基因组试剂盒方法提取瘤胃细菌DNA效果明显。Real Time PCR检测结果显示，构建的质粒DNA标准品可以得到较好的扩增曲线和标准曲线，溶解曲线峰形单一，检测样品获得较好Ct值。应用构建的Fibrobacter succinogenes特异性检出用质粒标准品可对实际样品中产琥珀酸丝状杆菌进行定量研究。

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